共定位分析

什么是共定位？

假设同事给您提供了一些图像，或者您自己有一些图像，并且您想要测量图像中两种染料或污点之间的共定位量。首先，您必须定义共定位的含义，这并不简单。一般来说，当我们评估共定位时，我们通常试图证明双色图像的两个通道之间存在显着的、非随机的空间相关性。这种相关性的具体性质以及它对您的研究意味着什么，可能会有很大差异。这可能意味着一个通道的一个信号包含在另一个通道的范围内，或者您的污渍/染料通常被发现相隔一定距离或通常聚集在一起，或者只是在以特定空间分辨率成像时来自两个通道的信号彼此重叠。重要的是，共定位结果不能表明两个蛋白质/分子结合或相互作用，只能表明它们都定位在一定体积内，并且主要取决于您的显微镜及其采集参数。无论使用什么显微镜，这个体积都比单个蛋白质的体积大很多很多倍。因此，共定位最常用于确定蛋白质是否定位于细胞器或其他明确的细胞结构。

有关共定位以及如何正确捕获适合共定位分析的定量荧光显微镜图像的更多信息，请参见此处：Image Processing Courses at BioDIP, Dresden。最近的评论是by Dunn in 2011。

明确说明决议！

Pauli exclusion principle 规定两个粒子不能具有相同的量子数，因此它们不能位于同一位置。所以，实际上没有什么是“真正”共定位的。在另一个极端，一个体素（当然不是立方体）的宇宙是完全共域化的——一切都在其中。实际上，我们的处境介于两个极端之间。我们必须在某个定义的和明确的空间尺度上进行共定位：在我们的例子中，光学分辨率或图像像素/体素间距，以纳米、微米、毫米、米、公里等为单位中较大的值。我们所做的共定位测量仅意味着与我们正在工作的空间尺度相关的任何内容，因此需要明确说明。此外，图像的空间分辨率必须足以实际支持您的假设。您可以在下面的“注意事项”部分找到有关光学分辨率和图像像素间距的更多详细信息。

###“颜色”并不重要

在大多数荧光显微镜图像中，多通道图像的所有“颜色”都是使用单色探测器捕获的，该探测器不知道撞击它的光子是什么颜色；这是由我们使用的荧光发射滤光片决定的。因此，显示的任何颜色都是错误的。这些假颜色仅用于区分哪个通道是哪个通道。如果我想将 DAPI 显示为绿色，将 EGFP 显示为洋红色，那么这没有什么“错误”。

在考虑共定位时，通常认为红色和绿色通道的合成图像就足够了。这是完全错误的。红绿合并图像的问题，除了红绿色盲人的明显问题外，还在于人眼和大脑的感知很容易被欺骗。看看这张图片：

大多数人可能认为该图像包含 4 种不同的颜色：2 组细螺旋为深红色和深绿色，2 组粗的突出螺旋为黄绿色和黄色。然而，黄色和黄绿色实际上具有完全相同的颜色！您可以通过拨打斐济的File › Open Samples › Spirals Macro自行验证。

那么…现在，您对通过寻找黄色斑点来确定共定位有何看法？没有多大意义吧？我们注意到，颜色的深浅和色调看起来会根据它们旁边的其他颜色而有所不同！因此，您需要根据像素值来测量某些内容，而不仅仅是主观地“查看”红/绿合并图像。

始终定量评估共定位的一个更好的理由是，这实际上告诉您正在寻找的东西 - 空间上两个像素通道之间的相关性（或不相关性）。

共定位分析方法

由于在评估图像时执行共定位分析的原因有很多不同，并且您可以使用许多不同的显微镜技术来获取这些图像，因此评估共定位的方法也有很多不同的方法。没有通用的最佳方法，每种方法都有自己的优点和缺点，但有些方法可能更适合您的数据或假设。

基于像素强度

在基于强度的相关性分析中，图像中的像素/体素值直接用于空间相关性的评估。这些可以大致分为两种类型：像素匹配共定位分析和基于互相关函数的分析。

逐像素方法

在逐像素共定位分析中，根据双色图像的第二通道中的相应像素来评估一个通道中的像素的强度，通常产生散点图，从中确定相关系数。由于这些方法简单明了，与传统的宽场荧光成像配合得很好，并且是最早的测量共定位的方法之一，因此得到了广泛的应用。然而，逐像素匹配意味着两个通道的信号必须重叠才能表现出正空间相关性。这对于超分辨率显微图像来说可能是个问题，其中分辨率的提高意味着即使是密切相关的强相关蛋白质在成像后也可能无法产生足够的重叠以使用这些共定位方法。此外，使用此方法时报告空间分辨率至关重要，因为图像的比例和分辨率会影响结果及其解释！

以下只是许多共定位系数中的两个，用于表示双色图像每个组件中像素级共定位对象的强度相关性：

1. 皮尔逊相关系数。 它对平均信号强度或范围的差异或两个分量之间的零偏移不敏感。结果为 +1 表示完全相关，0 表示无相关，-1 表示完美反相关。噪声使值比应有的值更接近 0。
2. Manders 分割系数。 与每个颜色通道中共定位像素或体素的荧光量成正比。您可以在Manders et al.中获得更多详细信息。值范围从0到1，表示一个通道中位于其他颜色通道中强度高于零（或阈值）的像素中的强度分数。

这些系数分别衡量共定位的数量或程度，或者更确切地说是相关性和共现性（但不应表示为％值，因为这不是它们的定义方式）。但如果没有什么可以比较的话，它们还有什么意义呢？ Costses 导出了统计显着性检验，以评估两个颜色通道之间 Pearson 相关性 r 的测量值显着大于相同信息仅随机重叠时计算出的 r 值的概率。该测试是通过随机扰乱一幅图像中的像素块（而不是单个像素，因为每个像素的强度与其相邻像素相关），然后测量该图像与另一幅（未扰乱的）图像的相关性来执行的。您可以在Costes et al.中获得更多详细信息。该测试的结果告诉我们我们测量的 Pearsons r 和 split Manders 系数是否优于纯粹的机会。

下面的示例（感谢 Tony Collins 提供了这张漂亮的图）通常演示了逐像素共定位分析生成的结果类型。

在散点图或二维直方图中，每个像素或体素的两个强度值相互绘制，颜色越亮，两个颜色通道具有这两个强度值的像素或体素就越多。在这里，我们可以通过肉眼观察，在二维直方图中间存在大量信息的情况下是否立即存在相关性。我们可以用线性回归拟合该云并测量相关系数。在两个颜色通道中设置阈值后，我们看到散点图或 2D 直方图被分为 4 个区域，即象限。各自的含量可用于计算不同的共煤化结果。

其他系数包括排序相关性，例如 Spearman 和 Kendal 的 Tau 以及 Li 的 ICQ。其他一些在文献中有所描述，但已被驳斥为不敏感，例如 Manders 论文中的重叠系数，J. Adler et al. 表明与 Pearson 的 r 和 Manders 的分割系数相比，其在解释上存在很大问题。

####互相关函数

另一种基于强度的共定位分析利用Cross-correlation (CCF) 来评估两个通道之间的相关性。在文献中探索这些技术可能会非常令人困惑，因为实际上有两种不同的方法可以将互相关函数应用于共定位问题，并且在讨论这些技术的手稿中通常没有很好地描述它们之间的区别，也没有一致的命名约定来区分彼此。评估 CCF 的两种不同方式是作为距离（空间互相关）或时间（时间互相关）的函数。虽然它们都使用相同的根功能，但它们是两种截然不同的方法，具有不同的成像要求，并且提供有关分子/蛋白质的非常不同的信息。

空间互相关

在空间互相关中，最初以与上述像素匹配方法类似的方式评估双色图像的两个通道的相关性测量（尽管确切的函数可能有所不同）。然后，一个通道相对于另一个通道移动（通常移动一个像素），然后使用该偏移重新评估相关性。在整个图像上重复此过程，以生成作为距离函数的相关曲线，如右图所示。与上面的散点图生成方法一样，空间互相关方法适用于单个图像，并且不需要多个时间点。

这种方法类型的一个关键优点是来自两个通道的荧光信号不需要重叠来证明空间相关性，这也使得这些方法与超分辨率成像更兼容。此外，图像中的任何分辨率或信号密度限制都会在该函数生成的曲线中捕获，因为该曲线是距离的函数。因此，只要结果中充分描述了曲线（通过高斯拟合或 FWHM 的标准差），就不需要报告显微镜的空间分辨率。然而，与一对一像素匹配方法相比，图像互相关的计算量可能非常大，因为每次图像移位后都需要评估相关性。这可以通过限制评估相关性的距离和/或轴或者通过在频域中执行互相关计算来加速，但是这些方法通常仍然比上述方法慢。

时间互相关

在时间互相关中，随着时间的推移，同时监测两个染色分子的强度波动。荧光强度波动的重合通常表明分子相互作用。与空间互相关相比，时间互相关的主要区别在于，时间互相关中的数据随时间移动，而不是通过空间移动。因此，任何时间互相关技术都需要随着时间的推移进行采集，并且不能在单帧图像或固定样本上执行。

第一个也是最著名的时间互相关技术是Fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS)。在 FCCS 中，使用共焦显微镜用两个激发激光照射单个衍射极限体积，并随时间同时记录两个荧光团的发射。然后将所得的两个荧光波动图进行互相关，以确定粒子是否一起移动，从而表明存在相互作用。然而，该技术不需要局限于单个焦点体积，并且最近的时间互相关实现将相同的方法应用于多帧图像，有效地评估图像每个像素的 FCCS 并对其进行平均。这些基于图像的时间互相关实现通常称为图像互相关谱（ICCS），但是，该术语也已应用于空间互相关方法，这使得很难找到合适的技术。如果您不确定，由时间互相关方法生成的图表的 x 轴将是时间（通常标记为 τ 或秒），而不是像素或微米。

基于对象的共定位

在基于对象的共定位分析中，图像首先segmented将两个通道的感兴趣对象与背景分开。然后使用这些二值图像评估共定位，通常通过将两个图像相交的面积/体积与以下各项的面积/体积进行比较：a)二值图像的并集，b)二值图像的差异，c)未改变的二值图像之一，或d)这三者的组合。您将交叉点与什么进行比较取决于所提出的确切问题。能够根据您的具体情况定制分析是基于对象的分析的最大优势之一。此外，通过执行以下操作，无需使用插件（尽管有些插件可简化流程）即可轻松执行基于对象的基本分析：在对两个图像进行segmentation之后，图像计算器 (Process › Image Calculator…) 可用于生成交集（AND 运算符）、差值（差值或减法运算符）和并集（加法或 OR 运算符）。创建这些数据后，可以使用particle analysis对其进行分析以确定面积/体积，或者可以将分析重定向到原始强度数据（Analyze › Set Measurements…）以评估粒子内的原始像素密度。一般来说，这种基于对象的共定位确实要求每个通道中感兴趣的对象之间存在重叠。然而，已经开发了可以对原始二进制图像执行距离分析的插件，消除了两个通道之间重叠的要求。

SMLM 共定位

由于单分子定位显微图像的独特性质，作为定位点列表而不是强度值矩阵，传统的强度或基于对象的共定位技术不足以对其进行分析，因此SMLM图像有自己独特的共定位方法。目前有两类 SMLM 共定位方法：邻近共定位和基于 Voronoï 的共定位分析。

共定位插件

有几个插件可用于执行共定位分析。除了下面描述的选项外，另请参阅list of extensions共定位类别。

按方法类型列出的插件列表

• 一对一像素匹配分析：
  • Coloc2
  • JaCoP
  • Colocalization finder
  • Colocalization Threshold（已弃用）
  • Colocalization Test（已弃用）
• 空间互相关分析：
  • Colocalization by cross-correlation
  • JaCoP
• 时间互相关分析：
  • ImagingFCS
• 基于对象的分析：
  • JaCoP
  • Distance Analysis
• SMLM 分析（无 ImageJ 实现）：
  • Coloc-Tesseler（独立，不是 ImageJ 插件）
  • ClusDoC（MatLab 插件）

流行 ImageJ 共定位插件的详细信息

科洛克 2

Coloc 2 实现并执行 Pearson、Manders、Costes、Li 等空间方法中的像素强度相关性，用于散点图、分析、自动阈值和统计显着性测试。

除非您正确设置成像硬件并正确采集图像，并对渗色和色移等进行适当的控制，否则这些都不会给出合理的结果。请参阅here for hardware set up guidelines。

该插件取代了 Colocalization Threshold 和 Colocalization Test 插件，不幸的是，它们存在缺陷且难以维护。因此，我们从头开始精心策划和设计了一个新插件。虽然下面也介绍了旧插件，但我们建议您使用 Coloc 2。

Coloc 2 的一大特点是标准化 PDF 输出，旨在使不同共定位实验的结果具有可比性。

请参阅Coloc2页面，了解有关使用 Coloc 2 插件的完整说明，包括其采用的像素强度空间相关方法的常见陷阱。

####雅各布

JaCoP 是共本地化工具的汇编：

• 计算一组常用的共定位指标：
  • Pearson’s coefficient
  • Overlap coefficient
  • k1 & k2 coefficients
  • Manders’ coefficient
• 生成常用的可视化：
  • Cytofluorogram
• 可以访问最近发布的方法：
  • Costes’ automatic threshold
  • Li’s ICA
  • Costes’ randomization
  • Objects based methods (2 methods: distances between centers and center-particle coincidence) 所有方法均适用于 3D 数据集。

有关完整详细信息，请参阅第 JaCoP 页面。

共定位查找器

Colocalization Finder 插件显示两个具有相同大小的初始图片的相关图（称为 scatterPlot 图片）以及原始图像的 RGB 重叠（称为 Composite 图片）。

有关详细信息，请参阅Colocalization Finder web page。

样本数据集

第一个样本数据集具有非常好的共定位，因为二聚蛋白的 2 个亚基分别用绿色和红色染料染色。 Pearson、Manders、Costes 和 Li 的方法对于该样本应该非常有效，但该数据集未通过下一节中提到的许多质量检查。

colocsample1bRGB_BG.tif：使用“图像 > 颜色 > 分割通道”菜单命令为 2 种染料获取单独的 z 堆栈（您可以扔掉蓝色的染料！）。

除了该数据集之外，Fiji 还预加载了“文件 > 打开样本”菜单下的许多样本图像。其中，有一些多通道图像可以用作共定位插件的输入（尽管它们不一定在通道之间具有任何空间相关性）：

• 共焦系列
• 荧光细胞
• 飞脑
• 海拉细胞
• 有丝分裂（多帧图像）
• 神经元（红色和绿色通道之间良好的共焦化）
• 柯蒂氏器
• 第一龄大脑

注意事项及注意事项

2D 或 3D 图像？

细胞以及细胞内外的一切事物在 3 个空间维度中存在并相互关联。只要有可能，您就应该执行 3D 共定位分析。您甚至可以评估活细胞/系统中随时间变化的 3D 共定位（4D 共定位分析），以获得更全面的结果。

检查您的图像质量！

在尝试对 2 个颜色通道图像进行共定位分析之前，您应该问的问题：

1. 图像数据是否有噪声？ 2.是否有有损压缩？
2. 强度信息是否饱和/剪切/曝光过度？
3. 均匀背景/探测器偏移是否存在问题？
4. 空间分辨率是多少？它是否足以支持我的假设？

首先，我们应该检查图像是否存在可能导致共定位分析方法失败或不可靠的问题。

1. 显着的噪声（像素值的不确定性 - 通常来自检测到的光子太少）意味着我们将使用的方法将大大低估真实的共定位，甚至完全无法给出真实的结果。 2.有损压缩扰乱了像素的强度信息，导致共定位结果或多或少是错误的。
2. 强度削波/饱和度是个坏消息。像素强度相关性测量依赖于真实的像素强度，并且当像素强度确实更高时，不会将其剪裁为 255！有关如何检测此类问题的详细信息，请参阅Detect Information Loss教程。 4.我们应该寻找错误的偏移/高背景（因为这会混淆自动阈值方法，因为零信号不是零像素强度而是一些更大的数字） 5、空间分辨率：

根据定义，图像的空间分辨率决定了您测量共定位的空间分辨率。在不同的空间分辨率水平下，结果会有所不同。如果图像是一个大像素，那么所有东西都会共定位！

根据恩斯特·阿贝 (Ernst Abbe) 的工作，光学显微镜的空间分辨率受到光的波长（以及物镜的数值孔径）的限制。分子/蛋白质的波长比可见光的波长小一个数量级，因此它们可能相距许多纳米，但仍然出现在同一图像像素中。这是真正的共定位吗？也许吧，但这取决于你如何定义它！

图像是否经过空间校准？如果不是，那么我们需要校准它们，以便我们知道 x、y 和 z 的空间采样率（考虑像素或体素大小）。请参阅第 SpatialCalibration 教程了解如何执行此操作。我们需要对图像进行空间校准，以便 Costes 统计显着性检验（如下）方法正常工作。

我们需要仔细考虑 x、y 和可能的 z 的正确或足够的空间分辨率。这取决于物镜的Numerical Aperture。您可以计算所使用的物镜的正确像素或体素大小，以获得该物镜真正可以看到的最大分辨率：[奈奎斯特计算器](https://svi.nl/NyquistCalculator]。本质上，像素/体素应比镜头分辨率小约 3 倍。另一方面，如果您只对较大的物体感兴趣，而不是物镜可以看到的最小细节，那么使用较大的像素或体素是有意义的。同样，这些应该约为 3比您想要解析的最小特征小几倍。 Nyqvist告诉我们空间采样应该比我们想要解析的最小对象小三倍左右。请记住，我们将在此处执行的空间强度相关性分析无法告诉您 2 个蛋白质在某些生物物理键合相互作用中结合在一起。然而，这可能表明，当这 2 个分子出现在空间样本（像素或体素）集中且强度高于我们将在下面计算的阈值时，它们会以相同的相对量出现。无论如何，这可能暗示“也许它们是结合伙伴或在同一大分子复合物中”。您应该使用 FLIM、FRET 和免疫共沉淀等生化方法来确定真实结合。

进一步阅读

• Image co-localization – co-occurrence versus correlation。
• A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy。

较旧的共定位插件

共定位阈值

Colocalization Threshold插件一次性为您执行多种功能。打开 colocsample1bRGB_BG.tif 数据集的“绿色”和“红色”堆栈并分割通道（见上文），选择菜单项“分析-共定位-共定位阈值”。接下来选择正确的堆栈以在通道 1 和通道 2 中进行分析。如果您愿意，您可以使用感兴趣区域 (ROI)，该区域应在运行插件之前定义。选中“显示共定位像素”和“显示散点图”（另请参见Why scatter plots?），关闭其他选项。您可以探索“设置选项”中的选项。第一次使用它时，请打开所有选项，以便您了解它的功能。

1. 它生成 2D 直方图/散点图/荧光图。这是一种可视化图像中所有像素/体素的像素强度相关性的好方法，并且可以立即告诉您诸如强度饱和/剪切、错误偏移、发射渗透（检测通道中错误染料发出的荧光信号）等问题，甚至同一样品中存在多个具有不同染料比例的共定位物种群体。可以将其想象为 FACS 或流式细胞术散点图；确实非常相似。
2. 对散点图中的数据进行线性回归拟合。即散点图中的白对角线，其梯度是2个通道的强度之比。
3. Costes 方法自动阈值确定。阈值是强度水平，超过该强度水平，您就可以说两种染料“共定位”。此方法使用迭代过程来确定散点图 2 个通道的哪一对阈值对于低于阈值的像素给出零值。这意味着强度高于两个阈值的所有像素都具有大于零的相关性，而低于阈值的像素则没有相关强度或具有反相关强度。该方法非常强大（只要您不愚蠢地击败它，即使用具有高偏移/背景的图像数据），并且完全可重现，这意味着您将始终获得相同数据集的相同阈值，以及相似数据集的相似阈值。阈值设置是共定位分析中的一个大问题。如果您使用允许手动设置阈值的工具，显然您可以获得您喜欢的任何结果，因为您主观地决定什么是共定位的，什么不是。这可能会让你的老板高兴，但这不太科学，不是吗？所以不要这样做！请改用 Costes 自动阈值！有些人说 Costes 方法设置的阈值太低，低于他们肉眼设定的阈值。这可能是真的，但手动方法是主观的并且完全不可靠。 Costes 方法设置的阈值始终意味着低于阈值的相关性为零。这是一件好事。

该插件最终将一堆统计数据和结果发送到结果窗口。您需要使用插件 GUI 的“设置选项”复选框将它们全部打开。其中一些结果并没有提供太多信息。它们按照有用的顺序列在这里：

1. 阈值 Mander 的分割共定位系数（0 表示没有共定位，1 表示完美共定位。每个通道有一个系数，它告诉您该通道中与另一个通道共定位的信号比例。当然，这对于两个通道可能有所不同！阈值 Mander 系数可能是您要发布的数字（不是 Pearson 系数，因为这些系数信息较少）。
2. 通过 Costes Auto 阈值方法设置的阈值。
3. 皮尔逊系数：整个图像、高于阈值的图像（对于非常好的共定位染料，应该接近 1）和低于阈值的图像（应该大约为零，因为这就是 Costes 自动阈值方法尝试设置它们的方式……所以如果它不接近零，则出现问题！）
4. 线性回归解决方案：如果图像数据接近理想，两个通道的平均强度相当，并且不存在偏移/背景问题，那么根据定义，回归线的梯度将接近于1，截距将接近于零。这些对于结果的质量来说都是好事。此信息在其他情况下可能不太有用，例如其中一个通道中仅存在稀疏数据，或者存在多个共定位信号群（散点图中的几个明显独立的斑块/斑点）。
5. ％体积和强度共定位值非常无用，除非您使用生物学相关的感兴趣区域，因为它们非常依赖于某个图像中有多少东西和多少背景，并且对于同一样本的不同图像，您将获得完全不同的值，这些图像碰巧具有不同的背景区域。在没有空白区域的图像中，例如组织样本，它可能是一个有用的数字。也许在某些情况下，高于共定位阈值的强度百分比可能是一个有用的值？有关不同测量的具体含义的更多说明，请参阅第 6.3 节第 http://www.uhnresearch.ca/facilities/wcif/imagej/colour_analysis.htm，或者查看代码。

共定位测试

Colocalization Test插件执行统计显着性的 Costes 检验（您应该在计算阈值曼德斯系数和散点图后始终执行此操作）。它位于菜单中的 Analyze › Colocalization › Colocalization Test

从下拉列表中选择正确的通道 1 和通道 2 图像堆栈。确保“仅当前切片”已关闭，并且“保留示例随机图像”和“显示所有 R 值”已打开。然后单击“确定”

然后，结果窗口将显示计算出的 P 值以及测试计算的一些其他详细信息。

Statistical Significance 的 Costes 方法依赖于图像的空间校准、物镜Numerical Aperture (N.A.) 的知识以及荧光发射波长来计算point spread function 在图像中覆盖了多少个像素。然后，它获取其中一个通道中的图像，并通过将 PSF 大小的图像块移动到新的随机测试图像中的随机位置来将其随机化。然后计算随机图像与另一个通道的原始图像之间的皮尔逊相关系数(r)。如果随机图像与另一个通道的真实图像的相关性与两个真实图像之间的相关性一样好或更好，那么您测量的任何相关性都不会比您偶然获得的该图像的相关性更好。该测试执行多次（100）次，并输出 P 值，即比真实图像具有更好相关性的随机图像的比例。 P 值为 1.00 意味着没有一个随机图像具有更好的相关性。 0.95 是 95% 的正常统计置信限。任何低于此值的值，以及您在真实图像中测量的相关性/共定位都不太可能比随机机会更好，因此可能并不有趣。

在这种情况下，P 值应为 1.00。由于您告诉它显示 Pearson 相关 (r) 值（此处为 R 值），因此它们位于另一个窗口中。您可以看到它们都接近于零，并且在结果中您可以看到平均随机化 R 值大约为零，这意味着随机化图像都与真实图像没有相关性。这是一件好事！ 其他可用的方法（例如 Fay 和 Van Steensel）执行相同的操作，但以不太严格但非常简单的方式随机化图像，这可能会导致错误，例如过高或过低估计 P 值。然而，它们比 Costes 方法更快。

同样，对于 Colocalization Threshold 插件，在这里使用 ROI 可能非常有意义，因为您只对图像中您感兴趣的生物所在部分的 2 个颜色通道之间的相关性感兴趣。背景通常是无趣的，您可以将其从分析中排除。使用与 Colocalization Threshold 插件中使用的相同的 ROI 可能是明智的！