前言

这些注释主要涉及基于像素强度相关性的共定位方法，其中寻找单个像素的不同颜色通道中的强度相关性。有时，寻找基于对象的共定位更有用，其中将对象从图像中分割出来，然后测试不同颜色通道中的对象的空间重叠：共定位。在基于对象的情况下，人们尝试获取适合分割的图像。以下原则适用于基于像素的共定位情况，但此处强调的大多数预防措施都是通用的。

简介

我们如何正确定义共定位？有人可以建议：

一幅图像中两个颜色通道之间的重叠程度，可以用以下特征来表征

• 共定位系数（关于整个图像的单一全局统计数据）
• 共定位图（空间上图像上共定位像素的识别）

通过在绿色和红色图像已进行颜色合并的图像中查找黄色来估计共定位是一个坏主意，因为：

1. 这是一个主观估计，取决于两个原始图像的亮度，因此对原始图像的亮度和对比度的操纵以及不正确的图像采集（尤其是饱和/超出探测器范围的图像）敏感。 2.很大一部分人是色盲，无论如何也无法区分红色和绿色。
2. 当 2 通道颜色合并图像显示在计算机屏幕上时，它们看起来与打印时不同。由于我们眼睛的工作方式，绿色看起来比红色更亮，红色比蓝色更亮。不同的打印机和不同的计算机屏幕会对相同的 2 通道颜色合并图像提供不同的外观表示，因此不可能客观地了解您所看到的内容并将其与其他人所看到的进行比较。
3. 有简单快速的客观方法来估计共定位，所以不要偷懒。您可以使用它们来获得描述图像中共定位的硬客观统计数据，而且很容易做到。
4. 我们的大脑发现的颜色对比根本不存在。在下面的错觉中（图 1），实际上只有 3 种颜色。 “蓝色”和“绿色”是完全相同的颜色：不要相信你的眼睛 - 测量它。

我们需要的是客观的定量方法来估计/测量 2 个颜色通道图像中的共定位。这些将输出共定位系数应该是：

• 对一个颜色通道与另一个颜色通道之间的共定位敏感；
• 对不相关背景的存在不敏感；
• 对通道之间强度的相对变化不敏感。

但是……为了对图像进行定量分析，必须以正确的方式获取它们，以便它们包含您要测量的信息！您还必须了解显微镜和数字成像过程的局限性。

图像分析时的注意事项

在显微镜下收集图像时需要理解和克服各种问题。任何聪明的分析都无法挽救蹩脚的图像（又名“垃圾进 - 垃圾出”原则）。如果您丢失或不收集显微镜在成像过程中可能看到的信息，那么这些信息就会永远丢失。我们在此列出了其中一些危险。谦虚地说，有些困难实际上是不可避免的，必须忍受，但仍然要理解。

模糊

Definition:图像的傅里叶频谱缺乏适当的高频。

Definition: 真实物体的小特征/边缘在图像中没有得到很好的体现。

这种现象会人为地放大物体的尺寸，使它们看起来更大。这样做的问题是，由于模糊，两个非共定位对象可能会在图像中出现共定位。这会产生假阳性结果。

模糊的可能根源是：

• 光学系统脏了（物镜、样品）
• 光学系统未对准（针孔、光学元件）
• 错误的浸油/盖玻片厚度/浸没介质
• 同样：物镜校正环未调整
• 机械漂移或移动样品 - 慢速成像时最明显
• 成像进入样品太深（油 < 5 µm，水 > 5 µm，2 光子系统 > 50 µm，并且您会看到由于物镜浸入介质和样品之间的折射率不匹配而导致的球面像差）
• 宽视野显微镜系统（或在共焦显微镜上 - 未设置 1 艾里单位的最佳针孔尺寸）
• 色移：如果您不知道它是什么，请始终使用复消色差物镜 - 这些可以纠正色差（蓝色比红色弯曲更好）
• 空间采样不足。如果您的像素太大而无法正确采样可见的最小特征，您将看不到这些特征。

有些事情我们无能为力（嘿，那是光学显微镜设施，嗯？）：

• 衍射：传统的宽场或共焦（通常使用 - 噪声有限）光学显微镜的空间分辨率受到衍射的限制，并且取决于光的波长（越短越好）和物镜的数值孔径 (NA)（越高越好）。 XY 分辨率优于 Z 方向的分辨率（对于高 NA 物镜来说，大约好 3 倍。应进行空间采样，以便在分辨率限制上不小于且不超过 2.3 个像素（根据 Nyqvist）。对于高 NA 镜头（例如 63x 1.4 油浸），这意味着 XY 中的像素应约为 80-100 nm，Z 中的像素约为 250 nm。另请参阅下面取样。

如果图像过于模糊，您可能需要考虑deconvolution。看看 SVI 的 this page，他们提供了 Huygens 软件，看看它能提供什么帮助。

背景

Definition:非特异性信号。

高背景的存在会产生大量人为的、不相关的共定位。您对非特定的共定位不感兴趣 - 如果您花费大量时间分析背景，您的审稿人可能只会稍微高兴。您不希望背景影响您的分析结果。

希望我们的共定位分析方法对背景的微小差异不敏感，但这没有理由不让它尽可能低。明亮的真实信号和低背景提高了信息的“动态范围”，这对于定量分析来说是一件非常好的事情。
在显微镜下，您必须确定图像的哪些部分是背景并且不感兴趣。然后，您可以设置显微镜，使图像中的背景强度值非常低或为零。

摆脱高背景？考虑：

• 样品/介质/浸没介质的自发荧光（例如酚红）
• 染色方案（不良的非特异性抗体……）
• 由于荧光滤光片设计不当，导致发射范围内的激发光泄漏
• 共焦显微镜中 PMT 探测器的“偏移”太低。

噪音

Definition:信号的不确定性。

像素中的共定位可能是错误的，来自噪声，因此不是真实的。 对于基于相关性的共定位分析统计方法，增加噪声会降低明显的共定位。因此，对于噪声图像，必须尝试抑制或去除噪声，以便更接近真正的无噪声相关性。约束迭代反卷积可以充当智能噪声滤波器，增加对比度并抑制噪声，因此应在共定位分析之前对宽场和共焦图像数据进行反卷积。

噪音类型：

• 暗噪声/暗电流。来自探测器中热生成电子的具有泊松分布的错误信号。 CCD/EMCCD/sCMOS：随着温度的升高而增加，因此我们使用冷却相机，那么就没有什么可做的，因为噪声非常小，并且只有在很长时间的曝光中才能看到。 PMT/共焦：冷却 PMT 有助于，例如。徕卡SP5
• 从系统中读取噪声/数字化仪噪声/电子噪声（共焦 PMT 可以通过 PMT 电压高于约 400 来克服它）。 EMCCD 非常灵敏，因为它们会放大暗噪声和读取噪声之上的小信号，以便您可以测量它。 sCMOS 相机的读取噪声非常低，仅为一个或两个电子，比 CCD 相机低几倍。
• 光子散粒噪声。这是来自荧光光子的信号中的固有统计噪声。随着时间的推移，它遵循泊松分布，因为光子会随时到达探测器。它的大小是测量的入射光子数的平方根。因此，我们可以通过增加曝光时间或像素停留时间并收集更多光子来增加“光子信号”与“光子信号噪声”的比率，但这与避免图像模糊的规则之一相矛盾 - 当样品移动时，可能会导致染料光漂白。在单点扫描共焦显微镜上，它可以提供更好的信号，检测到更多的光子，以远小于 10 微秒的像素停留时间进行更多的线扫描平均值，而不是以超过约 10 微秒的像素停留时间进行一次较慢的扫描（这是出于与染料暗态有关的复杂光物理学原因，例如三重态粒子的积累。）
• 放大噪声。增益越大，噪声越大。该噪声是高斯形状的。解决方案是使用较低的增益（在共焦上不要使用超过 800 左右的 PMT 电压，如果可以的话，将激光功率调高一点，或者进行更多的线扫描平均）。在 CCD（尤其是 EM CCD）上，增益不要太高，否则会给图像添加噪点。 信号必须足够强以允许足够好的信噪比，或者能够处理弱信号并将其与噪声分离，例如使用迭代反卷积！

串扰和渗透

Definition 1: 荧光团与光学元件（激发/发射滤光片、激光器、二向色镜）不匹配。

Definition 2: 您检测到错误染料的发射，并错误地认为它来自正确的染料。

所以…这是共定位实验中最糟糕、最危险的问题。可以用以下光谱来解释：

在该图中，检测装置被配置为测量第二荧光团发射的光。问题在于，在此检测通道中，第一个荧光团发射的一些光也被收集并集成到通道 2 信号中。这称为渗透。当您要计算该通道与第一个通道的共定位时，无论信号是什么，都会有一部分信号与其共定位，因为来自第一个荧光团的信号存在于两个通道中。也就是说，您生成了假阳性结果。

您可以通过选择性地仅激发 1 号荧光团并采集第一张图像，然后激发 2 号荧光团并采集第二张图像（顺序成像）来避免这种情况。但在这些光谱上，您可以看到激发曲线也重叠，并且激发波长有效地击中两种染料。两个荧光团都会在此波长下被激发；一个称为串扰的过程。您最后的希望是有一条激光线击中第一个激发光谱而不接触另一个激发光谱，并且反过来也接触第二个激发光谱。

染料的选择在这里至关重要。避免使用 DAPI 和 GFP，因为 DAPI 发射范围非常广泛，并且会渗透到 GFP 检测中。最好选择远红核/DMA 染色剂（如 Draq-5）与 GFP 一起使用。通过查看激发和发射光谱来选择染料，并选择与显微镜荧光滤光片和激光激发线相匹配的染料（例如，查看Thermo Fisher Scientific Fluorescence SpectraViewer）。尽可能选择光谱分离良好的脱色剂。 LMF 中的不同显微镜有不同的激发滤光片和激光线波长选择，以及不同的发射滤光片可能性。仔细选择染料。

空间采样不佳

Definition:像素大小不允许进行高度空间分辨率的共定位分析。

Definition 2:像素太大。不共定位的紧密但独立的对象似乎共定位。

作为一般规则，您应该对每个图像对象在许多像素上进行采样。如果情况并非如此，则无法可靠地做出共定位声明，因为该方法的假设不再成立。

假设您有两个具有不同颜色的对象，并且您想要评估它们是否在空间中共定位。如果我们假设它们不共定位，并且您使用的共定位过程有效，那么它应该会给您带来负面结果。考虑每种染料的一个分子。他们坐在一起，但并不共处（在同一个地方）。现在，如果像素大小太大以至于这两个分子在同一像素上成像，则该过程会告诉您它们是共定位的。您再次产生假阳性结果。

还要记住：由于我们正在研究光学显微镜，因此无论您做什么，两个比衍射极限更近且更小的物体都会出现共定位。在 Z 堆栈的情况下必须特别小心，其中 Z 轴的分辨率通常低于 XY 平面的分辨率。为了绕过衍射极限并确认您的共定位结果，您还可以使用其他方法，例如 FRET 或 FLIM，以及免疫沉淀或细胞共分离。

灌溉排水度

“像素”的问题主要发生在我们使用基于像素的共定位时（即当我们对空间上的强度相关性感兴趣时）。可以推除像素的强度造成的定量征。因为除here。因为除here。像素/图像信号（即像素的强度级别位于范围顶部，即8位则数据为255），它们会丢失有关样本中真实空间强度分布的信息。这是您分析中最重要的数据，通常是您对亮最重要的物体最感兴趣的信息-对吗？！这意味着在收集图像时丢弃这些信息是一个非常糟糕的主意。

色移

如果研究者的物镜质量较差或未进行色彩校正和/或存在其他倾斜问题，则同一物体在不同颜色通道中的图像将出现在不同的位置。即使是图像昂贵的镜头也会有一点残余色。这是非常严重的，因为这意味着，特别是对于较小的物体，则您会错过一些真正的共定位。成像前应使用多色1或0.5微米珠样本检查实验室，看看是否存在重大问题。如果在不同条件下拍摄珠子，可以图像校正的x、y和z颜色偏移。

有关更多详细信息以及可能的色移测量和校正策略，请参阅Chromatic shift origins, measurement and correction

###结论

考虑您的生物实验、染料和理论，并自始至终都要小心。收集适合定量的图像数据。例如，大约3-4种颜色和不同尺寸（小到足以进行检查推理）的Tetraspeck荧光珠可以形成良好的对比。

另外，要查看硬件部分，请阅读 Zucker, 2006 ¹。

学分
来自 Jan Peychl 的笔记。
这两个 gif 动画来自 Huygens Software wiki 页面。

进一步阅读

39个步骤：定义3D荧光显微镜的焦点故事，J.波利²。