Deconvolution corrects the systematic error of blur (loss of contrast in smaller features) in optical systems such as fluorescence microscopy images.
问题及解决方案
任何光学成像系统，例如视网膜物镜，都具有令人讨厌的特征，它会破坏越来越小的特征，越来越多的溶解，直到分辨率（原来）极限，之后就没有恢复（没有因此分辨率）。大的特征很清晰，但小特征缩小稀疏原始且较暗。这是一个系统愿景，系统的点扩散函数（PSF）为特征，使得图像强度信息成为非必然的。我们如果可以测量或修改光学假设PSF，图像我们就可以它的原始。既然可以修改这样的系统错误，我们就应该修改！
通过恢复图像恢复是修复系统（如望远镜物镜或望远镜镜头或镜头）中恢复损失的系统托盘的一种方法。我们尝试移动记录图像中由于成像点图像扩散函数（PSF）而由真实图像的模型（模糊、拖尾、小图像损失）引起的模糊影响。
通过反恢复图像是分析工作流程中修改量测量图像像素强度的重要系统修改步骤。如果我们不修改这个系统，则图像强度分析的结果可能比我们在分析之前修改图像的结果错误。这与称重之前将秤归零相同。
实用方法介绍
Bob Dougherty 的两个插件可以一起使用，在 2D 或 3D 图像中执行系统校正。其他插件也可用。Diffraction-PSF-3D 插件生成理论点扩散函数 (PSF) 的 z 插件库。或者，使用经验可以测量的 PSF。迭代反 3D 使用插件 PSF Image z 堆栈来校正样本图像 z 中的图像恢复与特征大小。下图是使用这些进行反面之前和之后从堆栈中获取的切片。
有关更多详细信息，请参阅插件主页： Diffraction PSF 3D 和 Iterative Deconvolution 3D
生成PSF图像堆栈
导电 PSF 3D 插件可用于生成理论 PSF，假设它们仅由导电产生。这些 PSF 晚间可能会与其他反导电插件一起使用。
要使用，请运行“Diffraction PSF 3D”插件。将出现一个对话框；大多数字段都是不言自明的。宽度、高度和深度值适用于 PSF 图像，而不是图像堆栈。所需值需要根据经验确定。尝试匹配获取原始图像的参数。
约束外资
在现实生活中的荧光显微镜（和其他）图像数据上，非负约束（复杂）迭代反结构算法极大地限制了简单的逆滤波器和维纳滤波器。
运行 Iterative Deconvolve 3D 插件，选择图像和 PSF。对于 2D 图像，请使用 2D（单平面）PSF。对于 3D 图像，请使用 3D PSF（z 堆栈）。然后从默认值开始，最初将迭代次数设置为 10。处理大型 3D 图像时请小心研究生不要内存。如果很顺利，请继续它们。
ImageJ 中的困境/困难/恢复困境
相关通过生育约束反堕胎（使用上述插件）进行诱导、逆转录和图像恢复的教育性治疗 ImageJ javascript 演示，请参见此处Convolution / Deconvolution / Contrast Restoration demo script
视频演示
提示和操作方法
由 E. Crowell 和 D. J. White 编译
点扩散函数 (PSF) 到底是什么？我为什么要关心？
PSF 是点光源通过透镜（或透镜组）成像的图像。它是描述光学系统中光的衍射的函数（形状）。对于显微镜系统，它可以从亚分辨率荧光珠的处理图像中导出，或者可以从光学理论方程计算近似值。
三种不同类型的 PSF 图像很有用：
- 使用光学系统对亚分辨率尺寸的珠子进行成像而获得的原始测量 PSF。
- 通过采集和处理多个亚分辨率尺寸珠子的 z 堆栈获得测量的 PSF。
- 输入描述光学系统的值后，由计算机程序生成的理论 PSF。
需要测量光学系统的PSF以确认不存在异常。亚分辨率微珠成像是检测光学系统中任何问题的灵敏方法。如果原始 PSF 中的艾里环高度不对称，则表明存在问题，例如物镜可能破裂、划伤、未对准或只是脏了。另一种可能性是盖玻片可能呈一定角度而不是完全平坦。
物镜的有效数值孔径 (NA) 也可以通过测量原始 PSF 中的光锥角度来估计。如果原始 PSF 具有优质光学系统的预期特性，则可以使用理论 PSF 进行反卷积，并且可以避免生成有用的测量 PSF（见下文）的耗时处理步骤。然而，由于没有完美的光学系统，高质量测量的 PSF 通常会比理论 PSF 提供更好的结果。
正常测量的 PSF 图像由直径不断增加的环组成的三维艾里图案组成，随着 z 位置的增加或减少，这些环从球形珠子辐射出去。如果镜片状况良好，艾里环应该是径向对称的圆圈。当正交观察时，荧光珠周围可见两个锥形光（点光源）。光锥不一定在 z 轴上完全对称，这取决于光学系统的质量。这种不对称性是测量的 PSF 的一个特征，这使得它在反卷积应用中优于理论 PSF。 z 轴上非常不对称的 PSF 表明存在球差，这是由于盖玻片厚度错误和/或样品安装与透镜浸没介质之间的折射率不匹配造成的。
为了成功测量 PSF，成像的荧光物体应表现为点光源。为此，荧光珠应小于系统的光学分辨率（例如 100 - 170 nm 直径）。光学分辨率=0.61。 lambda / NA ，其中 lambda 是荧光团的发射波长，NA 是物镜的数值孔径。如果一切都很完美，1.4 NA 物镜的光学分辨率为 250 nm。在最佳条件下，数字化图像中的像素间距应小 2.3-3 倍，范围为 80 - 100 nm 或更小，以满足奈奎斯特 - 香农采样标准并避免丢失信息、过采样或欠采样。
大于光学分辨率的荧光珠不会充当点源，并且由于其折射率高于安装介质的折射率，因此穿过它们的光会变形。
在采集 z 堆栈以生成测量的 PSF 之前，应考虑常规用于生成反卷积图像的采集条件。测量的 PSF 图像应进行充分采样，以便不会丢失任何信息，但其尺寸必须等于（或小于）要解卷积的图像尺寸。 PSF 图像必须“适合”要解卷积的图像。 PSF 图像在 xy 方向上应足够大，以容纳完整的艾里环，在 z 方向上应足够大，以使光锥可见且完整。
PSF 形状取决于三个标准：
- 荧光团的发射波长
- 使用的物镜（放大倍数和数值孔径） 3、物镜浸液介质的折射率
对于正确的反卷积，z 步长间隔也是一个重要因素，因为 PSF 图像和要处理的 z 堆栈理想情况下应具有相同的 z 步长间隔。也可以使用具有比要处理的 z 堆栈更小的 z 步间隔的 PSF 图像。
因此，必须为采集图像时常规使用的这些标准的每种组合采集/创建不同的 PSF。
对采集的 PSF 图像进行后处理以生成测量的 PSF
通过获取亚分辨率荧光珠的图像很难生成高质量的 PSF 图像。这种小珠子很少含有足够的荧光染料来产生高信噪比 (SNR)。因此，应使用相对较高的曝光时间（> 200 ms）获取 z 堆栈。应小心避免将曝光时间或灯功率增加到导致珠子快速光漂白的水平。如果在采集 PSF z 堆栈期间发生光漂白，则会因光漂白导致信号丢失而导致错误的 PSF。
珠子应充分稀释，以便每个视野平均只有一颗珠子可见。 （相邻的珠子将贡献自己的光衍射图案并使测量的 PSF 变形。）用于测量 PSF 的适当珠子应该具有较低的聚集倾向。然而，对于亚分辨率尺寸的珠子，人们永远无法知道成像的是单个珠子，还是一对或一小群珠子。因此，有必要对多个荧光珠进行成像并比较获得的 PSF。显示出良好对称的艾里环的那些代表有用的 PSF。如果获得的 PSF 均未显示出预期的模式，则光学器件可能存在问题（见上文）。
应针对 z 步长间隔、波长、物镜和浸没介质的每种组合获得 PSF。然而，测量低倍物镜的 PSF 是没有意义的，因为低倍物镜会提供采样不足的图像，或者像 DAPI 这样不需要去卷积的染色。
生成用于反卷积的有用测量 PSF 的最后一步是从堆栈中减去背景信号，以便在没有真实信号的情况下某些像素值将等于零。要实现这一点，只需测量堆栈中艾里环外部黑色区域的平均强度即可。该平均值代表图像中的背景信号，通常源自 CCD 相机芯片的正偏移/偏置。从堆栈中的所有像素中减去平均值（使用ImageJ › Process › Math › Subtract…）。如果省略此步骤，则在去卷积图像中可能会看到方形变形伪影。
获取针对反卷积优化的图像
最好在感兴趣的对象上方开始 z 堆栈，并在下方继续，以便覆盖样本中每个感兴趣点的 PSF。如果仅对样本的“焦点对准”部分进行成像，则反卷积结果不会极大地改善图像，因为信息丢失。
适当的 z 步长间隔可以根据阿贝/瑞利衍射极限方程 \(Dz = {(lambda \times RI) \over (NA \times NA)}\) 计算，其中 Dz = 理想的 z 步长间隔（以纳米为单位），lambda = 发射波长，RI = 安装介质的折射率，NA = 物镜的数值孔径。例如，使用 1.4 NA 物镜和 RI 为 1.5 的封片剂，1~350 nm 的 z 步长间隔适合于 FITC 荧光成像。
始终使用与采集测量的 PSF 相同的条件，或生成与您的确切条件相对应的理论 PSF。
如何进行反卷积
imageJ 有几个插件。最复杂的是 DeconvolutionLab (BIG - EPFL) 以及并行的 iterative 和 spectral 反卷积插件。
有关此主题的更多精彩且信息丰富的描述，请参阅Huygens deconvolution guide。
