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色移起源、测量和校正

对于光学显微镜的荧光图像，从共同定位的角度来看……

1.物镜从来都不是完美的，即使是所谓具有多色色彩校正功能的非常昂贵的物镜角度也不是完美的。当用例如构造构成的机构理论时。宽场/共焦/SPIM/超分辨率系统上的1.4 NA镜头在所有三个空间维度(xyz)中仍然会存在独特的色移，对于特定的镜头/光学器件组合，甚至对于其稠入的不是如此。

  1. 另外，不同的立方体中肋片的意义可能会划出不同的通道弯曲到检测器上标注不同的位置。在API OMX上，您甚至可以调整它……通常它在大多数系统上是固定的，但也可能是可调整的。

  2. 奥林巴斯在镜头中完成所有色差校正，但其他公司则在镜筒镜头中完成部分色差校正。

    1. This is why its not a good idea to screw a Zeiss c-apochromat 100x 1.4 oil into an Olympus stand.

  3. 因此，我们留下了一个可以测量的系统精度，实际上可以通过高斯完成珠图像或其他一些设计样本（就像您在 PALM/STORM 类型超分辨率和单分子跟踪中所做的那样）达到 10 纳米的精度。 5.在单点共焦扫描中，更复杂的光学器件使情况变得更困难。

    1. The Zeiss 510 has a different pinhole per channel… and depending on their positions and correct setup, the images of the bead in different channels is also affected by pinhole position settings. 6.如今，蔡司7xx、8xx系列以及奥林巴斯FV1000和现代其他点扫描仪只有1个用于发射光的针孔，因此该问题得到了抑制。
  4. 但是，405激光器通过与可见光激光器不同的器件进入相应。需要进行准直调整
  5. 2photon激光器也是如此……近让红外和红外激光点与可见线完全重合是很困难的……

  6. 因此，最好在硬件调整中解决合理地实现这一点，然后测量最终工件，然后对其进行修改。 10.总是存在可测量的托盘（除非你真的非常幸运并且碰巧拥有完美的镜头之一，这最多是千分的机会，再加上完美安排的荧光镜/滤光片） 11.好的，所以在简单的层面上，我们可以假设与参考（通常是绿色通道）相比，通道的整个视场发生了3D偏移（忽略任何几何扭曲或不同的放大倍率或不同颜色的图像旋转。）

    1. So if we measure a few 1 or 0.5 or so micron beads (no need to use tiny beads here) near the centre of the field of view (where optics are best) we can calculate or guestimate the center of mass of the bead images in each colour channel, and work out the shift vectors needed.
    2. These will be between 10-1000 nm in xy and up to 500 or even 2000 micron in z.
    3. BUT, they will never be whole xy pixels or z slice shifts… forget that idea its too crude.

    4. see the 2 slides titled “Check with multi-colour beads” at Colocalization analysis course notes 12.如何测量颜色通道偏移系统？

    5. psfJ from Knop lab can make the measurement.
    6. Use imageJ to do gaussian fits of the bead images and find the shidsts in x y and z.

  7. 现在我们可以使用软件通过相对于另一个图像颜色通道移动一个图像颜色通道来修复此系统错误。

    1. Erik M’s TransformJ Translate plugin in Fiji/ImageJ can do a sub pixel resolution shift for for each channel, as we have measured those shifts TransformJ Translate
    2. Use a nice interpolation method to avoid smashing the information in your images - eg quintic B-spline interpolation
    3. Or one could imagine a Fourier based method… (using a phase shift?) The Fiji [Stitching_2D/3D]] plugin contains stuff that might do this but its not exposed in the GUIs… so scripting would be required there? 14.使用整个像素或z平面升降移动图像来进行定位共定位分析似乎不够准确。

  8. 在较高级别上，不同颜色通道之间也可能存在放大倍数差异。

    1. Further, On multi camera systems, like OMX or some HCS system there WILL be a rotation angle difference between the channel images.
    2. The TransformJ Affine plugin might do the job, which can also expand or shrink the image to accommodate different magnification as well as shift and rotation.

  9. 更糟糕的是每个通道的非变形图像可能不同。

    1. Eg using a fancy beam splitter, dual view, W-view etc. gadget for dual camera imaging.
    2. Again these are measurable and fixable with some effort, eg using bUnwarpJ
  10. 因此，根据您需要的精度、视野的大小……校正的读数会有所不同。 18.我们可以通过重用 TransformJ 以及 bUnwarpJ 将这种颜色偏移校正添加到新的 Coloc_2 插件中。有接受者吗？