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简介
Kymographs are a way to represent on a single image a dynamic process. They are particularly useful to monitor in a glimpse a moving organelle and characterize its motion. They can be seen as a x-t scan, where the intensity along a given line is plotted for all images of a stack. Each time point gives a intensity line, plotted e.g. along the x axis of the kymogrpah. These lines are stacked along the y axis for all frames. So we get an image where we move along space in the x direction and along time in the y direction.
使用示例可以在本页导出的参考文献中找到。我们将使用 ImageJ 中最简单的函数在一个真实的示例中介绍它们。
上下文
这是一部在 MPI-CBG 的 Ewa Paluch 实验室制作的电影，漂浮的 L929 细胞（小鼠皮成纤维细胞），对层中被消融的肌球蛋白（RLC-GFP）进行染色。以各种方式传输的信号与 GFP 通道的共焦图像首先。肌动球蛋白表面是细胞的上部，位于膜下方。该平台很活跃，会产生水肿细胞体积的收缩力。此时，这种淀粉使动态细胞模型形成。
皮秒脉冲激光使我们能够在不破坏膜的情况下对皮层进行微消融。烧蚀激光功率使湿度周末，从而导致电影中出现白帧。
当在上游点消融时，对体积的限制可以被放松，形成皮层现在收缩，通过孔排出一些细胞质，就像用手挤压的松弛球一样。这导致了泡的，泡是膜的大致虚拟，最初没有芭蕾。一段时间后，新的面膜聚合和水泡缩回。这项研究的目的是获得气泡和收缩的动态。
气泡生长动态
首先，获取原始传输的电影here (22MB)。
我们想知道气泡前端生长的速度。最简单的方法是使用kymographs。这个想法是从细胞中心画一条贯穿气泡的线。要调整线位置，请选择气泡仍然放大的帧，并从中心贯穿气泡的一条线ROI。
使用剖面图检查特征（快捷键K或Image › Stacks › Reslice）。
这张照片上的边缘特征不太清晰。在大约7微米处，我们可以看到气泡前沿周围的暗像素和亮光晕生成了某种脊椎。
kymograph 包括如此相似，对所有切片的灰度级别（或彩色图像的颜色）强度进行编码。我们最初可以使用为 Z 堆栈创建的函数：Analyze › Plot profile命令（快捷键“/”），而不是为此创建插件。出现一个选项对话框；默认值对我们来说很好，只需按“确定”即可。然后我们得到 kymograph：
这里图像上，空间沿x轴编码，遵循从左到右的ROI线。由于我们从细胞中间到细胞外部不同了ROI，因此细胞内部测量的强度报告在图像的左侧。在几乎最右侧，我们得到了细胞的边界和气泡前沿。
时间沿 y 方向编码。第一帧测量结果报告在顶行，底行报告最后一帧。白色带对应于第 11 帧和第 16 帧之间的烧蚀，并出现在 kymograph 的第 11 和 16 像素之间。
ImageJ无法处理x轴和y轴不同的布局单位，这里就是这种情况（空间和）。因此，为了进一步分析，必须使用x布局的像素大小和y布局的帧间隔自行调整。我发现从图像中完全删除任何布局（甚至从源堆栈中）会更安全。这样就不会因我们以μm为单位测量的延迟而产生间歇。
在该白色带底部可以看到不断生长的气泡的前部，即图像右侧的暗边缘。在这里，气泡生长在白色带底部显示为一条相当陡峭的曲线。它的缩回需要更长的时间，这就导致当我们往上滚动的时候，暗色边缘向图像的左侧移动。细胞内部的其他特征也可以在其体积内部看到。就这张传输图像而言，它们就是我们在这里研究的各种颗粒运动。
为了获得气泡前沿动态，可以直接获取其坐标以进行进一步分析。我们还可以尝试自动对其进行分段。
- 使用File › Save as…命令，对气泡前沿施加压力。
- 设定阈值。
- 使用多线ROI沿边缘选择点，并使用Process › Find edges > XY坐标命令导出其坐标。
您现在有一个由两列组成的文本文件，第一列表示时间，第二列表示气泡前沿位置，准备进行分析。不要忘记进行正确的安排。
下一步是获取这种生长的数值和模型。我们把它留到另一个步骤，因为图像分析部分已经完成。 锻炼： You can also think of a more clever way to extract the front coordinates, with sub-pixel accuracy (please share your ideas).
泡前部的肌球蛋白动力学
现在下载here (22 MB)电影进行相同的实验，但在荧光通道中测量。它描绘了皮层肌球蛋白的动态。我们的目标是泡测量前沿生长过程中的肌球蛋白恢复率。这通常很复杂：我们正在尝试测量随时间变化的事物的强度。一个复杂的解决方案旨在以目标为目标，然后测量给出物体的强度。在这里，我们提出了一个涉及一些手动交互的简单解决方案。
首先调整分辨率，使噪波明显，从而放置正确我们的线ROI。因此，请使用§§0§§§并使用预设旋转。不要按应用：我们只是想改进我们在屏幕上看到的内容，而不是堆栈中存储的实际强度。然后画一条ROI线，像以前一样，从细胞中心到外部，穿过生长点。如果需要，请在调整之前重新分区。
使用 Reslice 命令从这部电影中获取 kymograph。您还可以使用 Fijim 附带的动态版本 Reslice，可在 Image › Adjust › Brightness/Contrast 中找到。优点是当您移动 ROI 时，kymograph 会实时更新。修复后，它应该看起来像这样：
我们可以通过该图像区分气泡生长动态，特别是当肌动球表情皮层重新聚合并重新形成可识别的外壳时的长时间延迟。然后它会出现在Kymograph底部的一条亮带处。我们也有父母或少妇给出答案：沿着走廊明亮的带，绘制了泡前部的肌球表情动力学。为了随时间测量它，我们只需从kymograph中对应一个顶部到底部并沿着气泡边缘的目的。本函数有一个很好的功能，可以在一定的线上宽上进行平均。您可以通过肖像斐济主窗口中的线条工具按钮来指定此宽度。
Plotting a profile on a kymograph
您可以看到肌球蛋白信号似乎在消融后不久。但这里有一个问题了这种方法的范围。注意是 x 轴的单位。这是一个以像素为单位的距离，最早您延迟以秒为单位。无论如何，它都不是，而是两者的混合。可以使用欧几里德距离工具计算它在 x 轴上报告的距离，即
\[s=\sqrt{(x_2-x_1)^2+(y_2-y_1)^2}\]但由于在我们的kymograph上，x坐标报告空间，y坐标报告时间，所以因此的x轴没有任何意义，并且不能按原样使用。 锻炼： Think of a way to get a profile where the x axis would be the correct delay measured from the ablation offset (please discuss).
