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本教程由 MPI-CBG Knust 实验室 Joao Firmino 为您带来。它涉及如何在长期延迟衰减过程中校正生物样本的适配器，以便使用斐济进行后续分析。对本教程内容的are welcome评论。
果蝇胚胎光漂白后的荧光恢复
在共焦处
以下教程使用 MPI-CBG 中的 DuoScan 共焦系统针对果蝇样本进行了优化。强烈建议在使用其他模式生物时优化已漂白和采集参数。
我使用 GFP 标记的蛋白质，因此通常使用的采集激光是 Argon 488nm，对于漂白，我使用 405nm 衰减。我将升级激光器输出功率设置为 45%，这样通过它的电流波形 6A。对于采集本身，我将激光设置为10%。在通道视图中，我取2μm的切片（这里可以通过针孔调整），通常会将增益滑动到750左右。漂白条件如下：488nm激光100％和405nm激光100％。使用的迭代次数是7 -这可能是实验中最重要的方面之一：根据蛋白质、模型生物和感兴趣区域的大小，应根据您的需要增加（这可能导致消融）或减少（这可能根本不会导致漂白）该数字。
由于您有兴趣获得荧光恢复的良好，因此在漂白后立即获得最大数量的时间点非常重要。这对于一个曲线的方面至关重要。因此，您必须获得具有足够好的快速分辨率的时间范围，以便进行进一步的分析和描述。我通常取512x512帧，缩放为3，采集时间约为1秒。
现在您必须确定实验的持续时间 - 这取决于多数蛋白质的恢复动力学，因此建议进行优化。在我的具体案例中，每个实验持续 21 分 25 秒。然而，这段时间有不同的采集率。前 5 帧每 5 秒拍摄一次，没有任何漂白剂 - 这将是您的预漂白条件（25 秒）。在此最后时间序列之后，您可以使用前面描述的条件漂白样品。稍后，您每秒拍摄 60 帧 -这将是您的快速采集后采集时间序列（1m）。经过这一分钟的高强度推理后，您可以将帧延迟延迟到中等水平（每5秒一帧，持续10分钟）- 采集后采集。最后，您可以每30秒一次采集一帧，持续另外10分钟-采集后采集。所有这些都可以通过使用DuoScan共焦系统中的视觉宏选项自动设置。一切完成后，您应该拥有4个个不同的时间序列总共205个帧。现在是分析结果的时候了……
分析数据
加载斐济4个不同的时间序列。
接下来，我使用 ImageJ 的 Concatenator 插件，可以在此处找到该插件 (https://imagej.net/ij/plugins/concatenator.html)。完成此操作后，应该仔细查看您的部分。如果它在图像采集过程中发生了移动，那么您的肤色 ROI 也会发生移动。您可以通过使用 Stephan Saalfeld 您设计的 Linear Stack Alignment with SIFT插件来最小化这种情况，该插件基本上将一帧跟前一帧进行比较，并尝试通过严格移动整个图像使它们更好地重叠来补偿最终的移动。这样你就不需要摆弄表情强度值，也不需要逐一手动调整投资回报率。当然，这个插件并不总是有效 - 如果您的样本移动很多则信号不允许进行有效，生成的电影将毫无意义。
一旦您获得了染色的影片，您就可以进行稀疏 ROI 并运行 ** 稀疏 Z 轴剖面**（在Images › Stacks下）。这不仅会向您显示随变化的平均强度值的图表，还会打开包含原始数据的测量窗口。将这些值复制到 Excel 电子表格中。您仍然必须将这些值进行标准化 - 图像的骤然以某种方式进行曝光样本，并且必须将影响这种最低。因此，对您来说，需要做的就是稀疏一个未漂白的ROI，并使用上述方法提取其所有值。
您可以使用以下等式标准化您的值：
\[I_{\text{norm}} = \frac{ I_{\text{漂白}} - I_{\text{nonbleach}} }{ \max (I_{\text{漂白}}-I_{\text{nonbleach}})-\min (I_{\text{漂白}}-I_{\text{nonbleach}}) }\]您将获得已归一化的 0 到 1 之间的值。您现在做的就是根据时间均匀的标准化值，您将得到粗略的恢复曲线。如果您想进一步分析这一点，您将必须进行这条曲线…因此，您可以随时与内部图像处理设备对话，如果您已经对§§§2或者§§§有了很好的了解，请自己进行操作…
