拼接 2D/3D

引文

请注意，Stitching 以及斐济提供的其他插件均基于出版物。如果您成功地将其用于您的研究，请引用我们的工作：

• S. Preibisch、S. Saalfeld、P. Tomancak (2009)“平铺 3D 显微图像采集的全局最佳拼接”，生物信息学，25(11):1463-1465。 Webpage PDF

简介

对大型生物样本进行高分辨率成像的需求日益增长。通常这些样本不适合显微镜的视野。为了克服这个缺点，使用移动样品的电动平台来创建整个样品的平铺扫描。显微镜载物台提供的物理坐标不够精确，无法从各个图像堆栈重建（“缝合”）整个图像。

2D/3D 拼接插件能够从任意数量的平铺输入图像/堆栈重建大图像/堆栈，利用傅里叶变换定理一次性计算两个 2D/3D 图像之间所有可能的平移 (x, y[, z])，从而在互相关测量方面产生最佳重叠。如果使用两个以上的输入图像/堆栈，则使用全局优化来确定所有图块的正确放置。为了消除图块边界处的亮度差异，应用了非线性强度混合。

拼接插件概述

Stitching 包附带 4 个不同的插件：

• 2D Stitching：拼接两个二维图像，矩形 ROI 可用于限制搜索区域。
• 3D Stitching：缝合两个图像堆栈（3D），矩形 ROI 也可用于限制搜索区域。
• Stitch Grid of Images：拼接以规则网格排列的任意数量的 2D 或 3D 图像（例如，大约 10% 重叠的 4 x 3 图像）
• Stitch Image Grid Sequence：缝合一系列 2D 或 3D 规则图像网格。
• Stitch Collection of Images：拼接任意数量的 2D 或 3D 图像，这些图像不必位于规则网格中。粗略的初始配置（哪个图像与另一个图像重叠）在图块配置文件中给出。
• Stitch Directory with Images (unknown configuration))：缝合位于给定目录中的所有图像，而无需了解图块配置。

2D 拼接和 3D 拼接

插件 2D/3D Stitching 将两个 2D/3D 图像作为输入。它们可以包含矩形 ROI，这将搜索限制在这些区域，但是，完整图像将拼接在一起。如果输入图像是 RGB 图像，用户可以选择使用哪些通道来确定正确的重叠。注意：如果拼接不成功，在明显重叠的区域使用 ROI 可能会解决问题。

应始终使用加窗，除非用户非常了解傅里叶变换的属性及其缺点。

峰值的数量定义了所检查的相位相关矩阵中的最大值的数量。如果缝合不正确，增加这个数字可能会解决问题。

目前有 5 种融合方法可用。

• 平均：在重叠区域中，计算两个图像之间的平均强度。
• 线性混合：在重叠区域中，两个图像之间的强度平滑调整。融合 alpha 定义混合函数（ alpha = 0 通过平均进行混合， alpha = 1 线性混合， alpha > 1 非线性混合）。
• 最大限度。强度：在重叠区域中，两个图像之间的最大强度用于输出图像。
• 最小。强度：在重叠区域中，输出图像中使用两个图像之间的最小强度。
• 红色/青色叠加：在输出图像中，第一个图像为红色，第二个图像为青色以可视化配准。在重叠区域中，强度应以灰度 (R + GB) 出现。由于显而易见的原因，这种融合方法不适用于 RGB 输入图像。

缝合图像网格

该插件能够拼接图像网格，无论是 2D 还是 3D 图像，只要所有图像都是同一类型即可。与两个图像的 2D/3D 拼接相反，该插件将从硬盘加载图像。 用户必须定义​​网格大小，这意味着输入图块的排列方式（例如 7 x 7 图像图块）。重叠是粗略估计。注意：较小的重叠会减少计算时间，但如果未找到正确的对齐方式，请首先尝试增加该值。

对话框中的下一个条目用于告诉插件如何加载网格中的图像。该目录应指向存储图像的目录。在文件名中，用户必须告诉程序文件的命名方式（例如 49 个不同的文件名）。文件的命名方式通常有两种：

• 图像数量不断增加：Tile_001.lsm Tile_002.lsm …. Tile_049.lsm
• 图像的文件名中包含 x 和 y 坐标：Tile_01_01.tif Tile_01_02.tif …. Tile_07_07.tif

这两种情况将描述如下：

• 图像的数量不断增加：Tile_{iii}.lsm - 索引号始终为三位数，并且从 1 开始计数。插件知道它必须计数到 49，因为有 7 x 7 个图块。
• 图像的文件名中包含 x 和 y 坐标：Tile_{xx}_{yy}.tif - 图块的 x 和 y 坐标的索引号始终为两位数，并且分别从 1 开始计数。该插件知道它必须数到 7，因为有 7 x 7 块。

x、y 和 i 的起始数字可以在下面的框中更改。该插件会将tileconfiguration.txt写入存储文件的目录中，如果需要，可以对其进行调查和更改。插件 Stitch Collection of Images 将采用这样的文件作为输入。如果您点击“仅保存图块配置”复选框，则插件将仅创建此文件并停止。

RGB 顺序可用于定义如何将不同通道（如果有多个通道）读入通道红、绿和蓝。

配准通道以及融合方法的工作原理与上面 2D 和 3D 拼接插件部分中所述的相同。注意：最大强度融合是最有效的内存拼接，因为它不需要一次将所有图像保存在内存中！

最后三个条目描述了全局优化的行为：

• 回归阈值：如果单独拼接后两个图像之间的回归阈值低于该数字，则假定它们不重叠。良好配准的典型值超过 0.7，但是在内容较少的噪声图像中，小的回归阈值也可以是正确的重叠。
• 最大/平均位移阈值：计算所有单独图块之间的重叠后，全局优化将计算所有图块的最佳排列。之后，与单独的对齐方式相比，一些图像对将被放置为彼此不同的位置，我们称之为位移。如果没有重大对齐错误，平均和最大位移将低于或约为 1 像素。如果两个图像之间的一个单独对齐是错误的，则这对图像将在全局优化中大量移位，因为所有其他连接图块将其拉向正确的全局位置。如果最大位移远高于平均位移，则意味着该单独对齐很可能是错误的并且将被删除。注意：如果不再有指向另一个图像的链接，则图像将被删除。
• 绝对位移阈值：如果绝对位移高于此值，则删除图像之间的链接。

如果您选中“仅创建预览”复选框，程序将不会注册输入数据，而只会显示文件的主要布局以检查您的输入是否正确。

拼接图像网格序列

该插件通过缝合一系列必须具有相同 X-Y 网格配置的图像网格来补充前一个插件。除了前面的参数之外，用户现在还必须选择部分数量（网格大小 z）、文件名模板（例如 Tile_Z{zzz}_Y{yyy}_X{xxx}.lsm）、起始 z 值以及存储所有生成的拼接图像的输出目录。

缝合图像集合

该插件采用任意图块配置作为输入，该配置必须存储在文件中。

例如，插件 Stitch Grid of Images 将创建这样的文件。

所有其他参数与第 Stitch Grid of Images 节中的解释相同。

Stitch Directory with Images（未知配置）

该插件获取位于给定目录中的所有图像，并尝试在不了解图块配置的情况下对齐它们。所有其他参数与第 Stitch Grid of Images 节中解释的参数相同。如果插件找不到正确的对齐方式，您可以尝试增加互相关阈值，以便仅使用质量非常高的成对对齐方式进行全局优化。这增加了优化器能够检测到正确的成对比对的机会。然而，这需要具有高质量的图像，否则具有相对较低相关性的正确成对比对被排除在外。

拼接多个系列或平铺扫描文件

该插件采用单个文件中包含的一系列图像，例如.lsm 文件格式。它依赖于Bio-Formats的系列支持。参数如第 Stitch Grid of Images 节中所述。

问题和已知问题

如果 Stitch Grid、Stitch Collection 或 Stich with Unknown Configuration 插件无法创建正确的输出图像，您可以使用 2D/3D Stitching 插件自行迭代。您只需从前两张图像开始并将它们融合即可。在明显相似的区域上使用 ROI，您可以强制进行正确的对齐。然后将结果与第三张图像融合，依此类推。除了时间消耗之外最大的缺点是你只能使用最大强度作为融合方法，否则图像看起来会很奇怪。此外，它会消耗更多的内存。

为了加载显微图像，我们使用 LOCI Bioformats 导入器。如果您在加载文件时遇到问题，请先将其转换为 TIFF，这样应该可以正常读取。

3D 拼接不适用于小于 3 像素的 z 堆栈尺寸。如果您想从非常薄的瓷砖重建此类图像，复制一些堆栈应该可以解决问题。

结果和计算时间

The figure shows stitched images of 3D confocal tiles. (A) shows a Drosophila melanogaster pupae expressing a GFP reporter under the regulation of the yellow gene, imaged few hours before eclosion using a 4× dry lens on an Optiphot confocal microscope (Nikon). It was stitched from three image stacks arranged in a 1 × 3 grid (Table 1 first row). The maximum intensity projection is shown. (B) shows the Drosophila larval nervous system stained with three dyes, stitched from a grid of 2 × 3 RGB images (see table 1 second row), the maximum intensity projection is shown. (C) shows a zone in the dorsal telencephalon of human embryonic tissue from week 17 post conception, incubated for 24 hours at 37°C in DiI. It was imaged using a 63×/1.4 objective on Zeiss LSM 510 equipped with a motorized stage. The final image was created from 24 image stacks arranged in a 4 × 6 grid (see table 1 third row), slice 18 is shown. Special thanks to Nicolas Gompel, James W. Truman, Simone Fietz and Wieland B. Huttner for providing the images. For interactive examples of these datasets have a look here. |瓷砖|单个瓷砖尺寸|图像输出尺寸|输出图像尺寸|计算时间|最小/平均/最大地质| |——|—————————————————-|————————————————|——————————–|——————————–|—————————————-| | 3 | 1024×1024×42 | 1097×2345×43 | 108MB（8位）| 0:42 分钟 | 0.00/0.00/0.00 像素 | | 6 | 512×512×86 | 975×1425×86 | 350MB（RGB）| 1:20 分钟 | 0.60/0.77/1.05像素 | | 24 | 1024×1024×68 | 3570×5211×70 | 1200MB（8位）| 22:43 分钟 | 0.49/0.76/0.99 像素 | | 72 | 72 72 512×512×122 | 3391×3847×145 | 1850MB（8位）| 43:10 分钟 | 0.00/0.39/0.64 像素 | | 63 | 63 63 1024×1024×92 | 6088×7667×119 | 5424MB（8位）| 178:57 分钟 | 0.00/0.66/1.18 像素 |

该表显示了在 2.67GHz 和 24GB RAM 的 Intel® 四核 CPU 上计算的拼接数据关系的示例。所有校准的全局校准的平均相位低于 1 px，第 1 行中的近似均匀，两个校准左右独立。请注意，计算时间与输出图像大小大致呈线性。

联系方式

对于任何类型的评论、问题或意见，请写信至 preibisch@mpi-cbg.de 或访问我的homepage。

另请参阅

• The Publication on the Stitching Plugin，S.普雷比施、S.萨尔菲尔德、P. Tomancak (2009) 平铺 3D 显微图像采集的全局最佳拼接”，生物信息学，25(11):1463-1465。PDF
• TrakEM2用于与浮动、可调整图像的无损切割。
• XuvTools弗莱堡大学的类似印刷软件以及随附书籍的abstract