LSM-W2 手册

LSM-W2 从激光扫描显微镜图像中提取叶表面形态。

安装

您可以使用 URL http://sites.imagej.net/Bionet.nsc/ follow an update site（LSM-W2 中的Optional Update Sites）。

说明：插件可以处理从激光扫描显微镜获得的 *.lsm 格式的多通道多帧 3D 图像。该插件的主要功能包括：

• 图像的构成和可视化。
• 提高图像质量（消除剪切和重叠，应用各向异性扩散 algorithm).
• 具有不同强度值的线性损伤 channels.
• 检测2D叶片表面。
• 蜂窝结构优化的应用 and nuclear layers.
• 手动修改底盘 regions.
• 标记 of cell groups.
• 细胞体积的计算和 nuclei.
• 通过相互排列比较细胞和细胞核。
• 下载单通道 tiff 格式的图像 processing (multiple images for each channel can be downloaded).
• 以表格和中间结果的形式保存结果 images, obtained at any stage of processing.

开始使用

启动插件后，选择 3D 图像 lsm 文件。该插件仅适用于 lsm 文件。

一旦从文件中读取显示信息，就会显示一个窗口，形成完整的多帧多通道3D图像所需的信息（上传窗口如图1所示）。要继续使用该插件，必须指定：

• X 轴和 Y 轴上的片段数。
• 总面积。总面积中交界处的部分 fragments is indicated as a percentage.
• 如果有需要，您可以通过压缩来减少消耗的内存量 the image (reducing the size and depth of color). Choosing this option will result in data loss and possible deterioration of the information received, but for stable operation of the plug-in, the memory consumption during the download phase should not exceed 50% of the available RAM. 指定所有必要信息后，单击“确定”并等待图像形成。

LSM-W2的主窗口

窗口标题显示有关图像的基本信息，包括当前切片编号和切片总、一个切片的大小（以像素和微米为单位）、颜色深度和图像大小。在主窗口的中央部分，逐层显示由所选通道（默认为通道1）的帧形成图像的图像。主窗口的底部有用于处理的按钮和字段。

按钮功能：

• “获取原始图像”按钮取消所有更改并返回原始图像。

• “应用偏移量” button is responsible for shifting frames on the specified number of pixels. Reusing this option shifts frames relative to their original positions (not the current one).
• “剪切图像” button cuts the selected area for all channels from the source image. Before applying this function, you must select a rectangular fragment in the image using the standard ImageJ tool.
• 这个 “Diffusion” button allows one to apply an anisotropic diffusion filter layer by layer for all slices of the selected channel. This button calls the plugin Anisotropic diffusion 2D.
• “Morf分割” button starts the plugin “Morphological Segmentation” (for more information, see section “The module of morphological segmentation by means of watersheds”).
• “细胞/细胞核信息”按钮 maps the segmented images of the cell walls and nuclei and displays the result in the table (for more details see section “Comparison of cells and nuclei images” section).
• “像素图” button allows one to plot the intensity change depending on the layer number (“depth” of the image). After clicking the button, one must point the pixel on the image by the mouse. This information may be used to visualize the influence of the parameter of the maximum “Threshold”, which is used for construction of 2D projection for the surface layer (see details below). This option helps to select this parameter and to study the specificity of the image.

图2 LSM-W2插件主窗口 ###主窗口说明（图2）

A. 图像通道切换区域。标准情况是图像中存在两个通道：细胞图像的通道（通道1）和细胞核图像的通道（通道2）。附加通道3是通过计算第一通道和第二通道的通道之间的线性组合而生成的。 许多功能，例如分割，指定选定的通道。

B. 用于指定构建上部单元层壁的 2D 投影的参数的区域。“获取 2D 图像”按钮根据指定的参数构建此投影：

• “下潜值”表示应从表层下降多少像素。
• 晶格尺寸指定 number of pixels between adjacent nodes for the algorithm of construction and calculation of the surface layer.
• 最大“阈值”（阈值） determines the optimal maximum of intensity. The maximum point is called optimal if it is a local maximum and if moving toward it to the left (the intensity increases), the intensity change at a single step (dx = 1) is greater than the set parameter “threshold”. C.加载新和保存当前图像的按钮块。加载图像选择选定通道的当前图像替换为新图像（适用于第一个和第二个通道）。下载后，许多选项被取消。重新加载图像会将图像放置在选定的通道上。这样，就可以为每个频道连续上传。所有原始元信息都为新存储图像。方法允许人们以不同的格式下载属于源的图像。图像的回复性默认检查，依赖于插件事件的图像专家的良心。能够保存工作的中间阶段，然后重新打开文件并继续处理，是附加功能。

D.“打开分割”按钮打开分割图像。

###用于处理叶子表面的窗口

它可以通过从原始3D共焦图像构建细胞结构到叶表面的投影来选择任何细胞层的表面。在构建细胞层叶面的过程中，通常认为最大强度集中在上层。图3显示了ZoX平面中样品的表面层。表明上细胞层的细胞壁着色良好，与下层细胞壁不同。

图3 细胞壁结构的ZoX投影 第一步是确定叶表面颜色最深的细胞层的平面。

首先，为了隔离表面，有必要确定强烈染色的细胞壁所在平面的层的范围。“Pix Graph”按钮用于根据层数强度变化。使用此选项，可以研究强度对3D图像中切片数量的依赖性（见图3）。

图 4 3D 图像切片上的强度分布图示例 与具有最大强度的像素相对应的局部顶点构建了叶子的上表面。

以下参数用于构建叶子表面。

阈值是指定强度局部峰值的参数。叶子上表面的点是最优化局部峰值，在该点的右半邻域内，信号强度图的恢复率超过指定参数的值。

潜水值是负责叶表面平面与切割平面之间距离的参数。该参数根据样品的染色强度和上层以及下层细胞的高度单独选择。

格子尺寸是一个决定网格密度的参数，允许以最小的稀疏曲面优化稀疏曲面的过程。参数值的增加与轴之间的绝对距离成正比，而导致轴数量减少，从而加快构建叶表面的过程。该参数的零值在每个像素中建立一个轴。构建叶子的稀疏表面后，将执行值的自动平滑生成的表面。

为了处理选定的表面细胞层，开发了一个附加窗口（图5）。该窗口以2D平面图像和相应的“表面手柄”形式可视化结果。“表面手柄”是一个2D图像，其中每个像素的值等于原始图像的切片数。对原始3D图像应用“表面面具”可获得上层细胞图像层结构的2D图像。

要在“表面报表”选项卡和“2D单元结构”选项卡之间切换，应更改标志“报表报表”。

图 5 用于处理表面细胞层的窗口的屏幕截图 “表面面膜”像素值的变化必然导致叶子表面构建过程的变化。“表面面膜”的平滑可以提高细胞结构图像的质量。通常，集成到 ImageJ 中的标准处理函数（中值滤波器、灰度形态函数）是有用的。

改进后，可以通过按“MorfSegmentation”按钮来评估 2D 分割。

分割模块采用标记分水岭分割算法

Morphological Segmentation集成到LSM-W2中实现图像分割。插件形态分割将形态学操作（例如简单扩展和形态梯度）与分水岭泛洪算法相结合来分割图像。主插件的图表如图6所示。

该插件可以标记处理细胞壁图像的（Border Image）和标记核细胞的图像（Object Image）。在使用插件 Morphological_Segmentation 的过程中，应指定参数 Tolerance，该参数表示局部轻微的强度。该参数需要根据图像进行单独的手动调整。

图 6 插件 Morphological_Segmentation 的窗口截图 按“运行”按钮后，应该等待主板处理。如果有必要，您还可以更改公差值并重复分割。然后执行以下步骤导入结果图像：

1. 选择结果图像显示类型为“集水盆地”(Results › Display)。 2.创建承载舞台图像的窗口（按创建“图像”） 3.关闭Morphological_Segmentation插件主窗口并返回 back to the window of LSM-W2 plugin. 4.“MorfSegmentation”按钮将更改为“获取结果”按钮。 The button “Get result” opens the window with segmented image.

   用于处理分割图像的窗口

彩色3D/2D图像是通过与LSM-W2集成的插件Morphological_Segmentation进行分割的结果。另一个窗口用于编辑分割区域。 图 7 用于处理分割图像的窗口的屏幕截图 处理分割图像的窗口说明：

A. 修复分割区域的最小像素数量。参数“坏区域中的像素数量”后，所有像素数量较少的元素将被从进一步考虑中删除。

B、“删除边界单元”按钮将删除边界上的对象。

C.“显示原始图像”按钮将返回原始图像。

D.“选择单元格”按钮允许选择分区区域。所选区域的索引显示在窗口底部。

E. 删除选定的分段区域。

F.“组合”按钮将选择后期的分割区域合并起来（“选择单元格”按钮将更改为“组合”按钮）。

G.“分组”按钮对选择后的分段区域进行分组。分组索引将在结果表中关联

H.“接触核”通过关联核分割的边界对象来校正分割的核。

I.“统计像素”按钮以 csv 文件测量结果。通过选择表中的元素来实现表和分区区域之间的导航。相应分割区域的颜色会发生变化。当您单击结果表中的区域索引时，该区域的索引将显示在窗口底部。

J. “保存”按钮将结果图像保存在tif文件中。

K.“取消”按钮取消更改并返回原始图像。

L.标志“核图像”表示具有核的图像。

细胞和细胞核图像的比较

算法：

A.运行LSM-W2并打开原始3D图像。

B.选择距离叶子表面距离d的一组点。

C. 对生成的2D图像（边界图像）进行分割并计算对象的体积。 C1 是结果表。

D. 对原始 3D 图像（对象图像）进行“核分割”并计算分割区域的体积（C1 是结果表）。 i. Mark the image with nuclei by the “Nucleus image” flag in the checkbox.

E. 通过按“细胞核”按钮计算细胞和细胞核之间的对应关系。 必须保持所有结果表和分段窗口打开才能正确工作。

G. 表格列： 1. cell number; 2. cell volume; 3. nucleus number; 4. nucleus volume; 5. fraction of pixels laying into the cell area. When there are mistakes in segmentation, the value P is less then one. ，其中 k 是细胞像素的数量； n 是进入内部细胞区域的像素数量。在细胞核区域与细胞内部空间不完全重叠的情况下，p 变得小于一。 H.结果图 测试 lsm 图像可用 here。