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聚类分析

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简介

Fiji-Plugin 用于分割和量化共焦图像。

在斐济安装插件

聚类分析插件集成在 ImageJ 的内置更新程序站点中，并且可以通过它进行定期更新。

直接进入您当地的斐济应用程序并单击 Plugins › Cluster Analysis 并输入 ImageJ Wiki 帐户 dcolam。之后，所有脚本和依赖项都应安装在正确的位置，您只需重新启动 Fiji 即可。

先决条件

唯一应该遵循的一件事是正确组织保存要分析的图像的文件夹。特别是，标题应具有相同的结构，这意味着所有有用的信息应由您需要指定的通用分隔符（例如下划线）分隔，并且所有图像应具有相同数量的信息（例如 XX_YY_ZZ.tif，另一个标题相应地应类似于 AA_BB_CC.tif）。如果标题长度不同，脚本会抛出错误。该脚本将启动一个数据库，从标题中提取信息，您可以稍后指定和描述。

https://raw.githubusercontent.com/dcolam/Cluster-Analysis-Plugin/blob/master/ExampleImage/Dialog5.png

如果您想排除特定信息，请不要在字段中输入任何内容

运行插件

成功安装后，您将在Update › Manage update sites › Add my site中找到三个部分，即脚本启动器、手册和帮助程序（将您重定向到此 github 存储库）以及 ini.cfg 文件加载器（允许您从其他实验中输入较旧的 ini.cfg 文件）。在启动脚本之前加载先前实验中的 ini. 文件，然后使用新参数运行聚类分析脚本。

一般脚本工作流程由几个步骤组成：

  • 整个实验的参数配置
  • 在数据集中随机绘制的图像上测试您的参数（如有必要，请重复）
  • 重新配置参数或开始实验
  • 在实验模式下，所有图像将在后台进行分析

参数配置

单击“聚类分析”后，应出现一个对话框，您需要在其中指定图像的输入文件夹路径。此外，您可以在无头模式下运行脚本，这意味着当前的ini.cfg以及先前运行的所有参数将被直接读取并直接在实验模式下运行。您还可以单击“设置测量”选项来选择测量类型，例如面积、平均灰度值、积分强度或周长来描述图像中的颗粒。此外，为当前运行设置一个名称。最后，该运行中存储的所有参数都将存储在具有实验名称的配置文件中。如果您使用相同名称重新运行分析，您的配置文件将被覆盖。

在下一个对话框中，系统将提示您为图像的每个通道定义多个详细信息。如果您的图像没有 4 个通道，请忽略您不需要的图像。您还可以单独命名每个通道并指定是否要执行粒子分析。另请确保单击“测试参数”按钮来测试所有参数是否设置正确。当省略 Z-Stack 选项时，分析将在图像的所有切片上运行。还指定标题中使用的分隔符，以便可以从图像标题中提取信息并在数据库中使用。

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您可以使用具有特定滚球半径的滑动抛物面执行背景扣除。此外，您可以通过定义的西格玛（半径）使用高斯模糊来过滤通道。还可以自动或手动调整亮度和对比度，尽管这两种方式都不推荐也不实用。模糊半径和滚球都取决于图像的分辨率。找到正确的参数很大程度上取决于您想要从一个通道提取什么信息。如果您需要检测小颗粒，强烈的模糊和背景减除会使颗粒变弱并且检测几乎不可能。一般来说，模糊半径越大，模糊程度就越大。相反，滚动的球越小，减去的背景就越高。

设置第一个对话框后，您将需要指定用于执行定量的参数，例如尺寸或圆度范围，以及要对其执行粒子分析的每个通道的自动阈值方法。您可以选择并测试多种方法，方法是将它们写在向下滚动按钮下方的文本字段中，仅用一个空格分隔。单击分水岭选项执行watershed algorithm，根据形状分离接近的对象。 您还可以与其他通道执行共定位分析，例如，如果您想计算原子核内部或外部的对象数量。只需勾选您想要执行共定位的相应通道即可。共定位算法的工作原理是使用粒子分析期间识别的对象作为另一个通道的掩模，并仅在主掩模内对所选通道执行第二粒子分析。您还可以将从主通道创建的蒙版放大一定数量（以微米为单位）（如果您的图像已校准，否则为像素）。

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为所有相应通道定义参数后，您可以选择手动分割图片中感兴趣的区域（在整个运行过程中您需要坐在屏幕前）或定义基于将多个通道组合在一起的附加粒子分析的自动分割算法。通过应用高斯模糊，可以过滤图像中的密集结构，例如核密集的大脑区域（例如海马中的锥体细胞层）或使用形态染色，例如树突标记（例如 MAP2）。自动分割算法始终还包括整个图像的量化，即使该算法无法检测到适当的掩模。尝试使用这些参数来找到适合您目的的组合。如果只想选择整个图像，只需将每个数字选项设置为 0 即可。

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还可以包括对主要细分结果的逐步细分分析，并以微米为单位定义步长范围。当您想要分析突触丰富层的片段（例如海马体的辐射层）时，这尤其有用。

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设置所有参数后，脚本将选择一个随机图像，并向您显示分析的所有步骤，以检查参数是否满足所有条件。当您对结果感到满意时，请按开始实验或尝试另一个图像或再次定义所有参数。旧参数将保存在 ini.cfg 文件中，并在您想要重新运行脚本时记住。

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海马 CA1 锥体细胞层（如红线）成功分割以及分割内特定 mRNA 定量的示例（红色阈值颗粒，绿色分割发现颗粒）。

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填充 GFP 的神经元的突触后和突触前标记染色示例。 GFP 被用作掩模来分别寻找突触后和突触前成分。突触后之间的共定位是通过将一个通道叠加到另一个通道并在叠加通道内进行计数（全部在 GFP 掩模内）来实现的。通过将叠加通道旋转 90°，可以估计两个通道之间的随机共定位（执行共定位分析时自动完成）

在实验模式中，脚本将在后台运行所有预处理和测量步骤。这将使分析速度更快。分析完成后，您将在原始文件夹中找到一个名为“粒子分析”的新文件夹，其中包含一个包含保存的感兴趣区域（.roi 文件）的文件夹，用于检查分割结果，以及预处理后图像的 .tif 文件版本。在“输出表”文件夹中，您将找到一个名为 Output.db 的 SQlite 数据库，其中存储了所有表和测量值，以及一个 ini.cfg 文件，其中包含已定义的实验参数。

您将在数据库中找到四个不同的表：

  • Particle_Analysis_Table 包含有关执行的每个测量的信息
  • PA_Measurement_Tables 包含每个已识别粒子的面积和平均强度等信息
  • Colocalization_Analysis_Table 包含有关两个通道之间执行的每次测量的信息
  • Coloc_Measurement_Tables 包含每个已识别粒子的面积和平均强度等信息

这些表也可在输出表文件夹中以 .csv-tables 形式提供。

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建议使用 DB-Browser（例如 DB-Browser for Sqlite (http://sqlitebrowser.org/)）打开 Output.db 文件以快速查看，但使用 Matlab、R、Python 或其他流行的编程语言导入数据集以正确分析数据。通常的例程包括创建与数据库的连接并定义包含条件语句的查询以正确检索相应的测量结果。

ShinyApp 用于分析和绘制 SQLite 数据库的结果（正在进行中）

使用 R 框架内的 ShinyApp 库，我们目前正在开发一种解决方案，允许人们以数据库的形式分析和绘制聚类分析插件给出的结果，而无需编写任何脚本。这项工作仍在进行中，应该很快就会投入使用。

无头模式

得益于 ImageJ2 的无头模式功能和集群分析插件，该程序能够在无桌面环境中运行，例如外部服务器（斐济预装）。在 bash-shell 终端（在 Linux 服务器中）中使用以下命令加载具有正确参数的先前测试的 ini.cfg 文件：

pathToFiji/Fiji.app/ImageJ-linux64 --ij2 --headless --run pathToPluginFolder/Cluster_Analysis/Load_Custom_ini_File.py 'inifile="pathToIniFile/ini.cfg"'

然后使用以下命令以类似的方式开始运行扭矩分析：

pathToFiji/Fiji.app/ImageJ-linux64 --ij2 --headless --run pathToPluginFolder/Cluster_Analysis/Cluster_Analysis_BETA_v2.py 'expath="pathToInputFolder/",headless="True",measure="False"'

确保所有路径都正确并指向正确的脚本和文件夹。包含电子表格和数据库的输出文件夹可以像往常一样在“pathToInputFolder/Particle_Analysis/Output_Table”中找到

如需了解更多信息，请随时与我联系。非常感谢此存储库的问题部分报告的错误和问题。