本页描述了 TrackMate 的检测器，它依赖于 StarDist 来分割 2D 对象。它不包含在 TrackMate 的核心中，必须通过其自己的 update site 模块安装。
安装
您需要订阅几个更新站点：
- CSBDeep更新站点，
- Tensorflow 更新站点，
- 前往StarDist更新站点，
- 然后前往 TrackMate-StarDist 更新站点：
CSBDeep 更新站点：
Tensorflow更新站点：
StarDist更新站点：
最后是TrackMate-StarDist更新站点。
完成所有这些后，请重新启动斐济。 我们您单独测试 StarDist，以确保它在安装后可以运行。这样建议我们可以更好地发现问题所在，万一它不起作用。例如，请遵循第 StarDist 页上的说明。
使用和教程
TrackMate-StarDist 附带了两个将出现在 TrackMate 中的导轨。安装 TrackMate-StarDist 并重新启动 Fiji 后，这两个导轨将以透明的方式集成在 TrackMate 中。我们在下面的四个教程中描述了如何使用它们。 他们按顺序描述：
- 在单通道图像上使用 TrackMate-StarDist。
- 在多通道图像上使用 TrackMate-StarDist 并利用强度信息。
- 将TrackMate-StarDist与自定义深度学习模型结合使用。 4.使用TrackMate-StarDist通过逐片方法分割3D图像。
StarDist在单通道图像上内置多功能核模型
StarDist 插件附带了一个非常的模型，可以分割二维几何图形的高效原子核，该模型是根据 2018 年 Kaggle 挑战赛的数据集生成的：
我们在第一个 StarDist 中使用了这个模型。
在第一个教程中，我们将使用一份跟踪核酸迁移的片段，并标记其细胞核。 您可以从 Zenodo 下载它：
首先启动斐济并打开斐济的教程图片。
我们使用教程数据中提供的P31-crop.tif file。
然后启动 TrackMate Image › Properties。
在标题为选择的第二个面板中，您应该在列表中看到两个新选项，其中一个是StarDist 钳。
选择它并单击下一步。
出现这个简单的面板。
请注意，这里面板中没有Stardist检测器的配置：我们使用该模型的默认值作为分数阈值和重叠阈值。我们观察到，如果使用默认值的模型不能很好地处理某些数据集，则更改分数和重叠阈值对结果几乎没有积极影响。因此，我们推断，如果模型和默认值不适合您的数据，那么最好针对您的问题训练特定的StarDist模型。
点击预览按钮检查分割结果。
这是我在教程图像中的第一个时间点得到的结果：
StarDist模型非常适合处理此类数据。 之后，您按照 TrackMate 中的后续步骤对所有时间点的所有单元格进行分段，然后跟踪它们。 最终我们得到这个结果时都使用默认跟踪器和默认参数：
它简单而快速，这意味着需要仔细检查丢失的细胞分裂和错误链接。
使用多通道图像进行 ERK 信号和运动测定
在本教程的这一部分中，我们将把细胞核中报告的ERK易位与细胞运动相关。我们将使用来自细胞迁移测定的图像，其中细胞表达第一个通道中报告的ERK，并在第二个通道中其细胞核进行染色。分析包括分割和跟踪细胞核中的细胞以及分析ERK通道中的强度。在第二部分中，我们将研究瞬时速度是否与细胞核中的ERK信号相关。 您可以在 Zenodo 上找到来源图片和附加文件：
使用 TrackMate 进行跟踪
步步：
-打开斐济。
- 打开你的图像。该图像有两个通道，通道1中的ERK报告基因（绿色）和通道2中的DNA染色（灰色）。
- 打开 TrackMate File › Save as…。TrackMate 开始面板将打开，显示有关图像尺寸的信息。单击
Next。 - “选择检测器”面板打开。从下拉菜单中选择
StarDist detector。检测器方法的描述将出现在面板中。单击Next。
- 将打开一个包含 StarDist 探测器描述的面板。通过单击
Segment in channel滑块，选择要分段的通道。在这里，选择通道 2，其中包含 DNA 标签。 - 通过单击
Preview按钮，您可以在当前帧上测试检测器。 - 当您对结果感到满意时，请单击
Next。 - 检测器将在所有时间范围内检测所选通道中的所有核。由于电影有很多时间点，这可能需要几分钟。
- 当进度条到达末尾时，单击
Next。 - 打开一个面板，用于根据检测到的点的质量对其进行过滤（有关此过滤的更多信息可以在此处找到）。在本练习中，这部分可以忽略。请点击
Next。
- 将打开一个面板，用于根据点的属性（即大小、形状、位置或信号强度）过滤点。在本练习中，执行以下操作：
- 点击面板底部的绿色加号 - 将出现一个过滤器。
- 单击下拉菜单并选择
Area。在这里，我们将过滤掉检测到的最小物体。确保Above按钮被选中。 - 将水平线（粉色虚线）拖动到值 30.92（大约）。如果您想输入准确的值作为阈值，只需在过滤器面板内部单击将其激活（变为文本红色），使用键盘输入您想要的数字然后。1 秒后它将被设置为阈值。
- 再次单击面板底部的绿色加号以激活第二个过滤器。
- 单击下拉菜单并选择
Mean intensity ch2。在这里，将过滤掉通道2我们中检测到的低强度物体。确保选择了Above按钮。将水平线（粉色虚线）拖动到值120.73。点击Next。
- 接下来，将打开一个跟踪面板。在此面板中，您可以选择跟踪对象的方法。在这里，我们使用
LAP tracker来解释可能分裂的细胞。请从下拉菜单中选择它，然后单击Next。 - 将打开 LAP 跟踪器设置面板。在此面板中，您可以选择如何跟踪单元格。首先，使用
Frame to Frame linking参数，您可以给出在帧之间链接对象的最大距离。这里使用 30然后，您可以选择可以少多少个点，并且它们仍然可以是同一个轨道。勾选Allow gap closing框并添加值：Max distance：30微米您和Max frame gap：5。接下来，让TrackMate知道是否可以允许分割轨道分裂细胞而导致。勾选框Allow track segment splitting并插入值Max distance：15微米。您重新在下面看到Track segment merging此处此框应保持未选中状态。单击Next。
- 跟踪完成后，会打开一个跟踪过滤面板。在此面板中，您可以根据轨道的属性（即长度、速度或位置）删除轨道。
对于上面描述的此处对象过滤步骤，单击绿色加号以添加过滤器。接下来，单击下拉菜单并从列表中选择
Track duration。确保Above已勾选，放置设置为其他30k。点击Next。
- 将打开一个带有轨道可视化选项的窗口。在这里可以根据轨道或对象的属性编辑它们的颜色。
- 首先，确保
Display spots和as ROIs框已勾选。 - 一种选择是根据通道1强度的标准差来标记荧光（细胞核）。在这种情况下，蓝色表示ERK活性报告信号随时间从而保持稳定。相反，红色将表明ERK活性报告信号随时间波动。通过这种着色，可以观察显示ERK活性振荡的细胞。
-为此，请从下拉菜单中选择
Color spots by Mean intensity ch1。单击下面的auto以展开信号颜色。 - 对于轨道，我们将可视化轨道地质。首先，确保您已从
Display tracks之后的下拉菜单中选择了Show tracks local in time。 - 接下来，在时间框中勾选
Fade tracks并选择Fade range14。接下来，从下拉菜单中选择：Color tracks by Track displacement。这将以蓝色显示移动短距离的轨迹，以红色显示移动最长的轨迹。现在您可以想象 ERK 振荡的存在是否与细胞行进的距离相对应。
- 首先，确保
- 在此面板中，您还可以将结果导出为 .CSV 文件。请这样，我们需要将它们在第二路径个中的 MATLAB 中进行分析。单击面板底部的
Tracks按钮。出现一个包含大量数据的窗口。确保导出Spots（有关该点的信息）和Edges（有关 2 个点之间的链接的信息）文件。关闭结果窗口并单击Next。
- 在下一个面板
Plot features中，可以得到较差轨道的一些特征，例如信号强度随时间的变化。但是，我们不能轻易引起瞬时速度与原子核中的ERK强度关联起来，因为前面是边缘物体的特征，上部是点物体的特征。我们将在第二部分中通过MATLAB分析脚本解决这个问题。否则Next。 - 在下一个面板中，可以执行不同的操作。对于本练习，我们将导出实验的跟踪图像。从下拉菜单中，请选择
Capture overlay。当您单击下面的Execute时，将打开一个弹出窗口。您可以在此处定义要保存的时间间隔。请勾选Hide image框并点击OK。 TrackMate将生成实验视频。
使用 MATLAB 进行跟踪分析
数据集的 zip 文件包含从上面第一个 Paty 生成的 2 个 CSV 文件，以及一个读取它们的速度并研究是否与 ERK 强度相关的 MATLAB 脚本。 我们在这里概述了脚本。
首先让我们加载数据。
clear
close
clc
% Path to the CSV files, exported from TrackMate.
spots_csv_file = 'CellMigration_WithERK-spots.csv';
edges_csv_file = 'CellMigration_WithERK-edges.csv';
%% Load CSV files into MATLAB tables.
spot_table = readtable( spots_csv_file );
edge_table = readtable( edges_csv_file );
%% Display info on tables.
fprintf( 'Header of the spot table:\n' )
head( spot_table )
fprintf( '\nHeader of the edge table:\n' )
head( edge_table )
Header of the spot table:
ans =
8×38 table
Var1 ID TRACK_ID QUALITY POSITION_X POSITION_Y POSITION_Z POSITION_T FRAME RADIUS VISIBILITY MANUAL_SPOT_COLOR MEAN_INTENSITY_CH1 MEDIAN_INTENSITY_CH1 MIN_INTENSITY_CH1 MAX_INTENSITY_CH1 TOTAL_INTENSITY_CH1 STD_INTENSITY_CH1 MEAN_INTENSITY_CH2 MEDIAN_INTENSITY_CH2 MIN_INTENSITY_CH2 MAX_INTENSITY_CH2 TOTAL_INTENSITY_CH2 STD_INTENSITY_CH2 CONTRAST_CH1 SNR_CH1 CONTRAST_CH2 SNR_CH2 ELLIPSE_X0 ELLIPSE_Y0 ELLIPSE_MAJOR ELLIPSE_MINOR ELLIPSE_THETA ELLIPSE_ASPECTRATIO AREA PERIMETER CIRCULARITY SOLIDITY
___________ _____ ________ _______ __________ __________ __________ __________ _____ ______ __________ _________________ __________________ ____________________ _________________ _________________ ___________________ _________________ __________________ ____________________ _________________ _________________ ___________________ _________________ ____________ _______ ____________ _______ __________ __________ _____________ _____________ _____________ ___________________ ______ _________ ___________ ________
{'ID20994'} 20994 0 0.87727 467.92 304.57 0 42303 141 6.8714 1 NaN 892.92 898 594 1070 3.1252e+05 109.68 141.27 144 78 190 49446 21.051 -0.18132 -3.6061 -0.1431 -2.2415 0.070632 0.064366 9.3421 5.0833 0.1923 1.8378 148.33 47.735 0.81804 0.97503
{'ID10754'} 10754 0 0.83571 451.67 218.51 0 20401 68 3.7286 1 NaN 993.1 1036 482 1167 1.0428e+05 155.98 141.02 146 72 227 14807 35.293 -0.32104 -6.021 -0.25705 -2.7649 -0.013069 -0.01824 4.2237 3.2984 -1.3372 1.2805 43.677 26.499 0.78161 0.92825
{'ID25602'} 25602 0 0.89615 490.18 292.33 0 51303 171 7.21 1 NaN 1040.2 1041 812 1215 3.9944e+05 85.512 138.93 144 93 184 53351 19.692 -0.11814 -3.2592 -0.14992 -2.4885 0.010226 -0.010218 8.186 6.407 -0.71347 1.2777 163.31 46.657 0.94274 0.98977
{'ID20995'} 20995 0 0.87711 482.46 273.57 0 42303 141 7.2147 1 NaN 870.72 888 548 985 3.3261e+05 78.431 139.42 142 85 185 53258 18.521 -0.1956 -5.3989 -0.13575 -2.3648 0.040536 0.073317 8.96 5.8645 -1.3124 1.5278 163.52 48.145 0.88651 0.98726
{'ID4611' } 4611 0 0.85884 458.63 210.1 0 6000.4 20 7.6966 1 NaN 1091.5 1094 843 1413 4.8246e+05 109.33 232.76 235 106 402 1.0288e+05 58.915 -0.16636 -3.9848 0.10675 0.76213 0.0078895 -0.021079 8.114 7.3583 -1.4064 1.1027 186.1 49.794 0.94321 0.98218
{'ID7684' } 7684 0 0.83752 468.28 214.64 0 13201 44 6.1328 1 NaN 1625.5 1652 1057 1858 4.5677e+05 159.43 325.73 308 184 536 91530 87.696 -0.098066 -2.2171 0.1099 0.73554 0.075046 -0.018995 7.3124 5.2173 0.24957 1.4016 118.16 40.901 0.88759 0.97731
{'ID29701'} 29701 0 0.87407 480.8 309.16 0 58804 196 7.4798 1 NaN 985.05 991 689 1161 4.0978e+05 106.2 135.36 138 89 174 56309 18.971 -0.11955 -2.5188 -0.18033 -3.1395 0.037025 0.0043714 8.6703 6.4975 -0.77281 1.3344 175.76 49.174 0.91339 0.98231
{'ID15878'} 15878 0 0.83024 461.84 250.16 0 31802 106 6.7081 1 NaN 912.99 937 464 1147 3.0676e+05 114.64 147.35 153 83 187 49510 21.257 -0.21064 -4.2504 -0.094686 -1.45 0.11303 -0.0094924 8.5511 5.3345 -1.3697 1.603 141.37 45.864 0.84455 0.9781
Header of the edge table:
ans =
8×13 table
Var1 TRACK_ID SPOT_SOURCE_ID SPOT_TARGET_ID LINK_COST DIRECTIONAL_CHANGE_RATE SPEED DISPLACEMENT EDGE_TIME EDGE_X_LOCATION EDGE_Y_LOCATION EDGE_Z_LOCATION MANUAL_EGE_COLOR
_____________________ ________ ______________ ______________ _________ _______________________ _________ ____________ _________ _______________ _______________ _______________ ________________
{'ID31545 → ID31681'} 0 31545 31681 2.0205 0.0037053 0.0047378 1.4214 62254 496.72 311.66 0 NaN
{'ID19256 → ID19400'} 0 19256 19400 10.28 0.010471 0.010687 3.2063 38853 487.15 248.62 0 NaN
{'ID14361 → ID14477'} 0 14361 14477 5.4277 0.010471 0.0077653 2.3297 28652 462.22 245.67 0 NaN
{'ID17824 → ID18039'} 0 17824 18039 1.2679 0.010471 0.0037531 1.126 36152 489.52 240.16 0 NaN
{'ID17160 → ID17216'} 0 17160 17216 83.774 0.010471 0.030507 9.1528 34652 461.37 257.23 0 NaN
{'ID7684 → ID7827' } 0 7684 7827 0.75557 0.009246 0.0028973 0.86923 13351 468.56 214.31 0 NaN
{'ID10506 → ID10604'} 0 10506 10604 3.6989 0.010471 0.0064104 1.9233 19951 452.52 219.05 0 NaN
{'ID22343 → ID22544'} 0 22343 22544 84.232 0.0017781 0.030591 9.1778 45153 487.83 277.45 0 NaN
如上所述，我们需要关联属于两个不同表的值：点表中的平均 ERK 强度和边缘表中的速度。
被定义为边缘特征，因为您需要两个点来定义速度和时间间隔，从而定义。
但我们想要相似点的速度和强度。
诀窍是使用现货 ID 值，该值在跟踪会话中是唯一的。
边缘表有两个列，存储其链接的2个点的ID：SPOT_SOURCE_ID和SPOT_TARGET_ID。
因此，我们需要使用点表中的ID列和（例如）边缘表中的SPOT_TARGET_ID来连接2个表。
在 MATLAB 中，按如下方式完成：
T = join( edge_table, spot_table, ...
'LeftKeys', 'SPOT_TARGET_ID', 'RightKeys', 'ID', ...
'LeftVariables','SPEED' , 'RightVariables', 'MEAN_INTENSITY_CH1');
head(T)
ans =
8×2 table
SPEED MEAN_INTENSITY_CH1
_________ __________________
0.0047378 917.44
0.010687 787.33
0.0077653 862.49
0.0037531 907.65
0.030507 1016.8
0.0028973 1606.6
0.0064104 1060.7
0.030591 1063.9
最后我们可以可视化是否与散点图有某种相关性。
figure
scatter( T.SPEED, T.MEAN_INTENSITY_CH1, 'k.' )
xlabel( 'Speed (µm/sec)' )
ylabel( 'ERK nuclei intensity' )
这么多点还是节日。让我们尝试更多点的浓密。
figure
histogram2( T.SPEED, T.MEAN_INTENSITY_CH1, 'FaceColor', 'flat' )
view( 2 )
grid off
box off
xlabel( 'Speed (µm/sec)' )
ylabel( 'ERK nuclei intensity' )
这还不是更清楚。我们来分析一下相关系数。
[ R, P ] = corrcoef( T.SPEED, T.MEAN_INTENSITY_CH1 );
fprintf( 'Correlation coefficient: %.2e\n', R( 1, 2 ) )
fprintf( 'P-value for the correlation: %.2f\n', P( 1, 2 ) )
Correlation coefficient: 4.00e-03
P-value for the correlation: 0.56
我们必须得出结论，该数据集并未显示细胞核中瞬时速度和 ERK 强度之间的相关性。 也许我们需要过滤掉一些低速点，或者调查整个轨迹。 但这留给读者作为练习。
使用 StarDist 探测器中的自定义模型跟踪明场成像的 T 细胞
您还可以使用您自己训练并打包为 zip 文件的自定义模型。 我们建议使用 ZeroCostDL4Mic 平台上的专用笔记本来执行此操作。检查ZCDL4M wiki page dedicated to training StarDist以生成这样的模型。
在本教程中，我们将使用我们自己训练的模型跟踪明场成像的 T 细胞。 您可以在 Zenodo 上找到图像和模型（打包为 zip 文件）：
首先打开教程数据中提供的位于斐济的名为TCellsMigration.tif的教程图像。
启动 TrackMate。在标题为 选择探测器 的第二个面板中，选择 StarDist 探测器自定义模型，然后单击 下一步。其配置面板需要几个参数：
- 在 自定义模型文件 文本字段中，您需要输入打包为 zip 文件的 StarDist 模型的路径（或使用 浏览 按钮导航到该文件夹）。在教程数据集中，该文件名为
StarDistModel-TCellsBF.zip。 - 分数阈值对应于概率图上识别对象的阈值。它接受 0 到 1 之间的值。
-
重叠阈值对应于非极大值抑制步骤中用于分离触摸/重叠对象的阈值；它接受 0 到 1 之间的值。
- 设置这些参数并单击预览按钮在当前帧上测试检测器。以下是我们在教程图像的第一个时间点上得到的示例（使用默认参数）：
- 如果结果满意，点击下一步进行全时间序列检测。 After the detection is finished, continue with the following steps same as in standard TrackMate workflow.使用默认跟踪器（简单 LAP 跟踪器）和默认参数，我们得到以下结果：
通过使用 TrackMate 跟踪 2D 标签来生成 3D 标签
在本教程中，您将学习如何使用 TrackMate 生成 3D 标签。 3D 对象的分割可能非常困难。 深度学习被证明非常有效，但仍然有许多模型和算法仅适用于 2D 情况。 在本教程中，我们“破解”TrackMate，使用 2D StarDist 分割算法来分割 3D 对象。 随着时间的推移，我们欺骗 TrackMate 将 3D 图像视为 2D 电影。 我们跟踪 Z 中的假 2D 对象，并使用生成的跟踪信息来重建对象的 3D 分割。 以下分步教程展示了如何执行此操作。
首先从 Zenodo 下载数据集：
数据集包含原始数据，但也包含中间标签图像，以防您想直接使用它们。
- 打开斐济。
- 打开斐济的
Spheroid-3D.tif图像。该图像是 MCF10DCIS.com 3D 球体的 Z 堆栈，已用 DAPI 染色以可视化其细胞核。 - 打开 TrackMate Plugins › Tracking › TrackMate。由于图像是 3D Z 堆栈，TrackMate 会要求您交换 Z 和 T 尺寸。这就是我们想要的；单击
Yes。
- 开始面板将打开，显示有关图像尺寸的信息。单击
Next。 Select a detector面板打开。从下拉菜单中选择StarDist detector。单击Next。- 将打开一个包含 StarDist 探测器描述的面板。 通过单击
Preview按钮，您可以在当前帧上测试 StarDist 探测器。如果您对结果感到满意，请单击Next。
- 检测器将在所有时间范围内检测所选通道中的所有核。这可能需要几分钟的时间。
- 当进度条到达末尾时，单击
Next。 -
打开一个面板，用于根据检测到的点的质量对其进行过滤（有关此过滤的更多信息，请参阅here）。在本练习中，这部分可以忽略。单击
Next。 - 将打开一个面板，用于根据点的属性（即大小、形状、位置或信号强度）过滤点。在本练习中，请执行以下操作：
- 单击面板底部的绿色加号 - 面板顶部会出现一个过滤器。
- 单击下拉菜单并选择
Area。在这里，我们将过滤掉检测到的最小物体。 Make sure theAbovebutton is selected. - 将水平线（青色虚线）拖动到值 31.47。
- 再次单击面板底部的绿色加号 - 将出现一个新的过滤器。
- 单击下拉菜单并选择
Max intensity ch1。在这里，我们将过滤掉强度较低的对象。确保选择了Above按钮。将水平线（青色虚线）拖动到值 45524.62。 - Click on
Next.
- 接下来，将打开一个跟踪面板。在此面板中，您可以选择跟踪对象的方法。在这里，我们使用
LAP tracker。请从下拉菜单中选择它，然后单击Next。 - 将打开一个用于选择 LAP 跟踪器设置的面板。使用此面板，您可以选择如何跟踪单元格。首先，使用
Frame to Frame linking参数，您可以给出在帧之间链接两个对象的最大距离。这里使用4微米。接下来，您告诉 Trackmate 可以缺少多少个位置但仍然是同一条赛道。勾选Allow gap closing框并添加值：Max distance：4 微米和Max frame gap： 3. 单击Next。
- 轨道过滤器面板打开。在此面板中，您可以根据轨道的属性（即长度、速度或位置）删除轨道。在这里，我们过滤掉最短的轨道以消除可能的伪影。同样，与上面的对象过滤一样，单击绿色加号以添加过滤器。单击下拉菜单并从列表中选择
Track duration。确保Above选项已勾选，并将滑块设置为 3.45。单击Next。
- 将打开一个带有轨迹可视化选项的窗口。在这里可以根据轨道或对象的属性编辑它们的颜色。我们不需要在本练习中使用它。单击
Next。 - 再次单击“下一步”。
- 您应该已到达
Select an action面板。在此面板中，可以执行不同的操作。在本练习中，我们将导出跟踪对象的标签图像。从下拉菜单中，选择Export label image，然后单击Execute。 - 在弹出窗口中，勾选
Export only spots in tracks框以消除任何未链接到轨道的对象，然后单击OK。
- 标签图像现已导出。请记住将斐济的尺寸从 T 更改回 Z Plugins › Tracking › TrackMate 并保存图像Plugins › Tracking › TrackMate。
- 可以使用 FPBioimage 以 3D 方式查看标签图像，并使用 3D ImageJ Suite 进行进一步分析。
引文
如果您使用该导轨进行研究，请引用StarDist和TrackMate论文：
doi:10.1007/978-3-030-00934-2_30
Dmitry Ershov、Joanna W. Pylvänäinen、Jean-Yves Tinevez - 2021 年 7 月
