用于基于强度的三滤波器组（比例）FRET 的 ImageJ 插件，适用于未知的变化的供体/受体比率，校正通道串扰和仪器校准，并产生定量的 FRET E 值。
简介
分子相互作用的评估通常基于福斯特（荧光）共振能量转移 (FRET)。几种方法依赖于测量供体和受体的荧光强度来确定供体淬灭和/或敏化受体发射的 FRET 程度。其中许多得出的 FRET 指数是半定量的、定性的，或者完全不知道实际的供体-受体比率。 3立方体方法基于测量供体特异性激发时的供体发射、受体特异性激发时的受体发射以及激发供体时的受体发射。正确描述每个通道中的信号源（考虑光谱串扰、仪器灵敏度和变化的供体-受体比率）可以导出 FRET 效率的定量正确表达式。这种方法已在 RiFRET 插件中实现，用于分析显微图像。当前版本还结合了逐像素自发荧光校正和大型数据集的批量模式分析。
安装
- 下载最新版本的Fiji。
- 启用 FRET 成像update site。
- 安装后，转至_插件 > FRET 成像 > RiFRET_。
用法
下载 PDF 格式的帮助文件here。
目录
菜单栏
文件
Open
使用文件管理器打开图像。
另存为 Tiff
以 tiff 格式保存选定的图像。
另存为 BMP
将选定的图像保存为 BMP 格式。
保存消息
以 .txt 格式保存消息窗格的内容。
明确的信息
清除消息窗格。
从 CSV 加载参数
加载先前保存的校准因子、阈值、背景 用于批量或手动的模糊值和半径 评价。
将参数保存到 CSV
保存校准因子、阈值、背景以供将来使用 已针对给定优化的模糊值和半径 测量/数据集。
批处理
打开批处理对话框(described later)
全部重置
重置先前完成的步骤的按钮的“外观”， 并“清除”之前“设置”的供体、转移、受体、AF 图像 – 如果用户设置不正确的频道，则可能有用。可能会 在批处理运行完成后也很有用。参数在 文本字段是有意保留的——最好关闭并 再次打开程序以清除这些。
图片
Stack to Images
分割选定的多通道图像，以便将每个通道视为一个 独立图像。通过使用“设置图像”功能在步骤中为它们分配适当的角色，可以在分析过程中使用生成的窗口。
平铺图像窗口
将打开的图像设置为平铺视图。
###敷面膜
应用从 32 位图像创建的选定 32 位图像 阈值化（包含 NaN 像素）作为另一个图像的掩码。任意 掩模图像中与 NaN 不同的灰度值被视为统一。的 当“设置 应用要屏蔽的图像”命令。两个图像必须相同 尺寸。该命令打开此对话框：
设置输入图像将其重命名为“Mask image – date”和“Image 掩盖——日期”。输出图像为 32 位并命名为：
蒙版图像 1（蒙版中的像素）
蒙版图像 2（蒙版外的像素）
注册捐赠者频道
这将向捐赠者注册转移和接受者通道 二维通道（自发荧光通道的注册不是 支持是由于预期缺乏与标签的相关性）。 图像配准是使用 Fast 的实现来执行的 哈特利变换（FHT）。图像首先被复制，向前 变换到频域，共轭乘法为 执行（这相当于空间中的互相关） 域）。最后，将图像逆变换回空间图像 域。然后使用最大值（峰值）来移动 X 和 Y。目前， 不支持子像素移位。注意：图像配准需要图像 尺寸为 2n 和正方形（例如 512×512）。登记结果 将会输出到日志中。
计算图像比率：计算两个选定的 32 位图像的比率
将图像转换为 32 位：将图像转换为 32 位格式。
Gaussian Blur
应用选定的 σ 1/e2 半径的高斯模糊。 （以前的用户 RiFRET 请注意，版本 1.x 中使用的高斯模糊具有 相同值设置下半径增大 2.5 倍，现在是 已弃用。）
阈值
打开 FIJI 内置阈值功能。注意：需要 32 位图像 将高于和/或低于值设置为 NaN
直方图
创建所选图像的直方图
LUT火
将火灾查找表应用于所选图像
LUT 频谱
将光谱查找表应用于所选图像
更正
逐像素自发荧光校正：启用逐像素自发荧光校正 自发荧光功能。 （更改插件的主窗口）
使用插件进行逐像素自发荧光校正
主窗口具有逐像素自发荧光校正
计算校正和校准系数
这些因素可以手动输入或使用图像计算 计算按钮。
计算 S 和 B 因子
所有窗口均实现光谱溢出因子的计算 （S 和 B 因素）遵循相同的逻辑。 S1、S3、S5 因子可以是 仅在供体样本上计算，受体上的 S2、S4、S6 因子 仅样品和未标记样品上的 B1、B2、B3。
首先，应设置荧光通道。如果只有堆栈 可用，请使用Stack to Images。当 单通道图像可用，选择捐赠者通道，然后单击 在设置捐赠者通道图像按钮上。与另一个重复此步骤 渠道。所有图像均自动设置为 32 位深度。
背景减法
仅供体和仅受体样品可以都是无细胞标准品或 标记的细胞（见手稿）。 B 因子的样本应该相同 将测量 FRET 的细胞，但不进行标记。
对于每个通道，有两个选项用于将值定义为 减去。 选项1: select a ROI with the FIJI built in options in the donor channel in the case of S1, S3, S5 in the acceptor channel in the case of S2, S4, S6, and in the autofluorescence channel in the case of the B factor window. Click on the button (optional:) Copy background ROI. The selected ROI will be copied to all the channels.
选项2: If the background value is known you can type it into the boxes under the text Constant: 当点击每个通道的减法时，插件会检查是否有 是图像中的 ROI，减去 ROI 的平均值，还减去常数。所以取决于样品 用于 S 和 B 因子，ROI 平均值或常数 应该使用。 (i)为了从基于细胞的样本中获取S因子， 背景投资回报率应该位于图像的无细胞部分，并且仅 仪器背景（包括持续的噪音、反馈 地表等）将被减低。这仅在以下情况下有效 与信号相比，样品的自发荧光可以忽略不计 可以通过使用低AF和高表达水平的细胞来实现 对于S因子，即使FRET也可在低表达上测量 和/或高 AF 单元。在这种情况下，通常应保持为 0。
如果S因子可以根据标记的低表达和/或 高 AF 细胞相同，细胞的平均背景，但没有 标签，需要确定并输入为相同。在这种情况下， 不宜存在有效的投资回报率。 （对于方法，使用的样本 可以使用B因子）。
(ii) 最佳解决方案是使用无细胞调整样品 S（见手稿）。在这种情况下，仪器背景 应在无荧光团的染色负载玻片上测定，并且 作为常量输入，同时不应激活任何 ROI。
(iii) 对于 B 因子，FRET 将在相同的样本上进行测量 - 但没有标签-需要使用。在这里，背景投资回报率应该 位于无细胞区域，通常应为0，否则不应有ROI 激活，以及独立测量的仪器背景输入为 使用时确保背景投资回报率不包含单元格 逐像素自动校准。
阈值按钮可打开内置的Threshold window of Fiji。 选择适当的阈值后，应用它并 应选择设置为 NaN 选项。所选择的阈值可以是 重置与重置。
当选中显示图像（用于手动计算）框时，插件 显示图像结果，否则仅提供结果。
通过计算可以生成结果。
该组（S1、S3、S5 等）将计算值评价主组 窗户。
重置会重置窗口中的步骤以进行新计算。
设置epsilons的比例
该值通常为~0。用于计算染料的准确值
对和激光器的使用，参见（手稿，方程5）
\(epsR = \frac{\varepsilon_{A.exc}^{D} \bullet \varepsilon_{D.exc}^{A}}{\varepsilon_{D.exc}^{D} \bullet \varepsilon_{A.exc}^{A}}\)
epsR 是供给体和捕获染料的乘积
扩散波长处的摩尔吸收系数
它们在自己的激发波长下的吸收系数为。
对于大多数染料来说，这个数字小得可以忽略不计。
###计算α
为了计算α因子，提供体通道的强度 (I1) 仅在供体上，增量通道 (I2) 仅在接收体上 需要样品。您可以对 I1 和 I2 使用与 分别为S1/S3/S5 和 S2/4/6 因子。选择后 适当的窗口，按“M”键测量并复制/粘贴 结果到对话框。
Ld 是在提供体上染料的平均数量
La 是吸附剂上添加的染料的平均数量
Nd：供体在细胞上标记的接收量的平均数量
Na：供体在细胞上标记的接收量的平均数量
εd/εa：供体染料的摩尔吸收系数之比 / 供体激发波长处的捕获染料。这些可以 使用染料和仪器光的光谱数据计算 来源。
当这些数据不可用时，可以根据 吸收光漂白实验并激活选项“计算” εd/εa”。应设置光遮蔽的供体， 调整背景值和阈值，然后单击“计算”按钮 εd/εa 旁边的文本框。
由于从采集光漂白计算实际的 FRET E 实验通常需要进行各种修改，彻底修改的 Ebl值可以通过使用相同组输入数据来获得 AccPbFRET 此类插件（参见参考资料）。在情况下，手册设置在 Ebl 应选择输入对话框。
请注意，以这种方式确定α因子只是一个 当标记细胞的自发荧光为 与荧光信号最佳相比可以忽略不计。为了获得结果， 使用标记标记蛋白但没有细胞的标准载玻片，以及使用 建议提供 εd/εa 的精确光谱数据。
计算 FRET
当所有校正因子确定后，可以计算FRET E 在双标记样品上。
第1步：打开并设置图像
应打开双标记图像。
打开并设置为频道：
内置image opener of Fiji 启动（所有支持的图像格式都可以通过这种方式打开）。如果 图像位于堆栈中，可以使用Stack to Images分割它们 在IJ菜单中。
当单通道图像打开时，选择有供体的窗口 频道并单击步骤1a中的“设置图像”。继续转移， 吸收和自发荧光通道以相同的方式。
###第1步：打开堆栈
当选中“使用堆栈”时，主窗口会发生变化：
点击“打开并设置堆栈”，built-in image opener of Fiji 开始。选择一个堆栈，打开后出现如下窗口 应出现：
应写入堆栈中相应通道的位置
以数字形式出现在对话框中。通道编号
以 1 开头。
单击“确定”，图像堆栈被分割，生成的窗口为
正确命名。
###步骤2：模糊通道
步骤可选，用流程图，模糊的接口接口 可以输入。该插件使用Gaussian Blur 斐济的职责。当只有低信噪比图像时，它可能是一个有用的工具 可用。 （请注意，所有通道都应该被模糊化 半径相同）
第3步：消失背景
这里遗失的背景应该只是仪器背景 包括持续的噪音、表面的反馈等。 像素上考虑了细胞或组织的自发荧光 使用计算出的B细胞按像素为基础 previously。 选项1: select a cell-free ROI with the FIJI built in options on the donor channel, and click on Copy ROI. The selected ROI will be copied to all the channels.
选项2: If the background values are known from an independent cell-free sample, you can type them to the boxes under the text Constant: 请注意：当点击每个通道的减法时，插件 检查图像中是否存在活动 ROI 并减去平均值 ROI 的值和还有常数。所以如果有一个背景 选择ROI，常量应保持0，如果非零 使用常量，请不要选择背景 ROI。 ###步骤4：阈值化
设置测量荧光通道的阈值。简单和 可以为所有肋骨通道定义增加。 应用按钮，给定最大和最小范围的外部像素 将被设置为NaN。FRET E值仅根据数值计算， 因此，如果像素在任何通道中为NaN，则在FRET E中将其设置为NaN 图像也是如此。使用重置按钮，所有像素都会重置为它们的状态 原始值之前的任何阈值操作。
###步骤5：创建FRET图像
可以使用“创建”按钮创建FRET E图像。演出时 选中的校正的供体和已接收图像框，还有 FRET E 和 光谱溢出和自发荧光校正的供给体和吸收 图像正在创建中。
###步骤6：设置FRET的图像阈值
FRET E 通道定义最简单和顶部。 应用按钮，给定最大和最小范围的外部像素 将被设置为NaN。使用重置按钮，非阈值FRET E 图片可以重新加载。
步骤7：将FRET图像保存为TIFF
使用built in FIJI image exporter保存 TIFF 格式图像
此命令校正后的提供体和接收保存图像到 当显示校准的供给体和接收图像选项时 激活。
###步骤8：选择ROI并进行测量
测量整个 FRET E 图像或标记其中的活动 ROI RiFRET 使用自定义结果创建自定义结果表 用于计算像素数而不是 NaN 像素的实现， 附件、中绘图、SD、简单和顶部。请注意计算的列表 参数是固定的，IJ/FIJI 偏好其内置的“测量” 函数不影响结果。这些结果也可能有不同 与IJ/FIJI计算的精度相同水平。
为了测量多个ROI，FIJI内置了ROI管理器并测量 需要使用函数。
关闭图像按钮可关闭原始图像和计算结果 图片。
使用没有逐像素自定义荧光校正的插件
主窗口没有逐像素自动荧光校正
如果没有逐像素抗体荧光校正，主窗口不会 显示B细胞因子的框，以及设置B细胞因子的按钮 自发荧光通道。与像素自动对焦的其他区别 下面突出显示了更正。
平均天然荧光校正
该插件模式提供了另一种自发荧光 其中使用平均天然荧光剂的校正方法。这些 每个通道的值，包括细胞/组织 AF 和 仪器背景，确定后可作为输入 他们使用具有相同数量的未标记细胞/组织样本 设置。（与确定B细胞因子的样本相同） 用于逐像素校正。）我们仅建议平均校正 如果细胞自发荧光是空间性的，则使用细胞数据的方法 同质。
或者，可以在 FRET 图像中使用无细胞 ROI，但是 这只是校正仪器背景，包括 噪声、表面反射等。这仅建议用于 与以下情况相比，细胞/组织自发荧光可以忽略不计 标签信号。
计算S因子
在S因子中，如果没有逐个核苷酸核酸，则仅确定因子S1-4。
背景减法
请参见above，但仅限 S1/S3 和 S2/S4 计算后只需打开并使用这些图像。
批处理
批处理适用于与 FIJI 兼容的正交图像格式。 当开始处理新数据集时，建议首先执行 手动分析整个过程并验证所有 参数正确。
然后可以将分析参数保存到CSV文件中：文件 > Save Parameters to CSV.
分析参数可以从 CSV 文件加载 File > Load Parameters from CSV。
当加载 CSV 或在中以其他方式确定参数时 主窗口中，可以开始批处理。 文件>批处理 加工
1.当出现描述批处理的窗口时，单击“确定” （应先阅读内容）
2.选择输入目录。
3.选择具有适当参数的CSV。保留并使用 当前显示在主窗口中的参数，只需单击取消即可。 4.以数字方式设置通道顺序并单击“确定”(see above)
该插件将生成并测量选定的 FRET 图像 阈值。 FRET图像和校正通道图像（如果 选中此选项）将保存到名为Output的目录中 在父输入目录中（如果没有，则创建该目录） 存在）。
引文
该软件基于图书。如果在工作中使用它，请您引用：
另请参阅
如果您使用接收光漂白 FRET 方法，我们推荐我们的其他 FRET 插件 AccPbFRET。
