焦点分析仪

Foci Analyzer 是一款综合性 Fiji 宏，用于检测、分析和可视细胞化和组织 2D/3D 显微镜图像中的核/细胞焦点。

可以以不同的成像方式（共焦、宽场）的图像中、高效可靠地检测焦点，具有多种分辨率。 输出数据包括带焦点统计数据的详细表格以及带焦点的分段细胞在原始图像上的最大值。对具有两个焦点通道的图像进行共定位分析，并以丰富成像力的重叠图显示。

作者：Bram van den Broek，荷兰癌症研究所，不足。如有疑问，请使用标签@bramvdbroek的image.sc forum。

工作流程总结

1. 使用预先训练的深度学习网络StarDist（2D / 2D 投影）对细胞核进行分割。另外，借助 BIOP 的Cellpose wrapper for Fiji，深度学习网络Cellpose可用于分割细胞核或整个细胞（2D、2.5D 或 3D）。或者，可以使用经典阈值+分水岭（但不能更改参数）。

2. 在每个细胞核中以 2D 或 3D 方式检测焦点。在高斯差值背景减法之后，检测局部热点放置其配置MorpholibJ的marker-controlled watershed的种子（使用CLIJ2/CLIJx在GPU上执行）。另外，AreaMaxima局部深度检测可以重置检测方法。 每个图像的阈值会自动计算为细胞核中（已产生异常值的）焦点信号标准差中值的3倍，并且可以使用阈值偏差校正进行调整。

3. 在单个通道A或两个通道A和B中对焦点进行量化。 对于每个细胞核，表格中报告了许多指标：焦点计数，以及焦点强度、面积/体积和整个细胞核强度的工具/中值。 如果选择两个通道，基线自动计算通道之间的焦点共定位。 该表保存为.tsv文件，可以在其他程序（如Excel）中轻松打开。

4. 分段的细胞核心和焦点被可视化为原始图像上的放大倍数，以便于检查。如果需要，可以在处理所有输入图像之前调整焦点检测设置（阈值偏差、最小/最大尺寸）。测量两个通道时会创建共定位图。

安装/要求

Activate以下斐济更新站点（在菜单栏，通过“帮助”->“更新…”）：

• 焦点分析仪
• 3D ImageJ 套件
• CLIJ
• CLIJ2
• CLIJx辅助
• CLIJx辅助扩展 ——CSB深
• IJPB 插件
• 星距
• TensorFlow
• (SCF MPI CBG) - 只有当您想使用焦点检测方法“AreaMaxima 局部顶点检测”时才需要

从 Fiji 菜单运行 Foci Analyzer：Plugins -> Foci Analyzer -> Foci Analyzer。 Combine result files可用于将输出.tsv合并文件到单个文件/表中。

如果您还想使用 Cellpose 分割，您还需要：

• Python（conda 或 venv）中的工作 Cellpose（2.0 或更高版本）环境
• 激活PTBIOP更新站点，并进行正确的设置。有关详细信息，请参见here。

使用手册

该宏以一个包含所有选项和参数的大对话框开始（单击可放大）： 该对话框有几个（颜色编码的）部分，如下所示。单击OK后，将记住此对话框中的所有设置。

文件设置

• 输入文件：您可以在此处指定要分析的文件。只需使用按钮将它们添加到列表中，或直接从文件资源管理器窗口拖放即可。输入图像应该是多通道图像。 （RGB 图像将转换为具有通道 1：红色、2：绿色；3：蓝色的复合多通道图像。）每个文件应至少包含一个具有细胞核染色的通道和一个具有焦点的通道（尽管技术上它们可以相同）。文件格式可以例如为 .tiff，或斐济（即生物格式）可以打开的任何专有显微镜文件格式，包括作为系列打包到单个文件中的多个图像。

• 仅处理具有扩展名的文件（对所有文件留空）：如果列表中存在多种文件格式，则仅处理以此扩展名结尾的文件（例如tif、czi）。

• 输出文件夹：将写入所有分析图像和结果输出文件的文件夹。

• 将输出文件保存在与输入文件相同的文件夹中？ ：选中时，输出图像和结果文件将保存在与输入文件相同的文件夹中。

图像设置

• 从之前分析的图像加载设置？：选中后，将弹出一个单独的对话框，可以在其中选择输出.zip文件（覆盖或共定位图）。所有设置均从保存的图像中的元数据加载。这个大对话框中的脚本参数条目将被忽略。

• 原子核通道：包含原子核的图像通道。对于 StarDist，核分割是使用此通道执行的，这总是发生在 2D 中（在最大强度投影上的 3D 图像的情况下）。对于 Cellpose，有两种可能性，具体取决于下面_细胞质/膜通道_的值。

• 细胞质/膜通道：包含细胞质或膜的图像通道。如果设置为 -1，则仅在细胞核通道上执行分割。如果 not -1 且 Cellpose 选择为 segmentation method，则在此通道上执行分段。在这种情况下，细胞核通道是“附加辅助通道”。如果_not_设置为-1并且选择了StarDist，则该通道不会在分割中使用，而是仅显示在叠加图像中。 （默认值：-1）

• 焦点通道 A：第一个焦点通道（默认值：2）

• 焦点通道 B：第二个焦点通道（默认值：3）

• 同时检测通道 B 中的焦点并执行共定位？ ：如果选中，将分析通道 A 和 B 中的焦点，然后进行简单的共定位分析。 （默认：选中）

• 2D/3D 焦点检测：此参数确定应如何分析 3D 图像中的焦点。对于 2D 输入图像，此设置将被忽略。选项有：
  • 检测 3D 焦点（或 2D，不适用时）（默认）使用 3D 滤波器和 3D 标记控制的分水岭功能执行焦点分析。连续切片中的连接焦点被计数一次。
  • 检测最大强度投影上的焦点 对 MIP 投影执行 2D 焦点分析。
  • 检测扩展焦深投影上的焦点 对 EDF 投影执行 2D 焦点分析。
  • 检测标准偏差投影上的焦点 对 STDEV 投影执行 2D 焦点分析。
  • 检测总强度投影上的焦点 对 SUM 投影执行 2D 焦点分析。
  • 使用准 2D 焦点检测（在每个 Z 切片中单独检测焦点） 将 3D 图像中的每个 z 切片作为单独的 2D 图像进行分析。当 z 间距非常大并且每个焦点仅在一个 z 切片中可见时，此设置非常有用。因此，连续切片中的连接焦点将被多次计数。
  • 仅处理单个 z 切片（在哪个切片下方指定）允许用户仅分析特定 z 切片中的焦点。

  通常，2D 投影分析可以提供令人满意的结果，与真正的 3D 分析相比，这些结果更容易可视化/检查，并且处理速度更快，且牺牲最小（例如焦点强度）。

• [仅单个 z 切片焦点检测] 切片 nr：用于上述选项的单个 z 切片。对于任何其他选择，此参数将被忽略。

• 删除图像边框（像素）：可以删除图像的边缘。当图像边缘具有非常不同的强度，导致不正确的自动细胞核分割时，这尤其有用。 （默认值：0）

• 分析前的图像 XY 合并：可选像素合并，以防分辨率非常高且焦点由许多像素组成。值为 2 表示：2x2 像素将合并为 1 像素。这可以减少图像中的噪声并加快分析速度。 （默认值：1）

细胞核/细胞分割设置

-细胞核/细胞分割方法：

• Stardist 细胞核分割 2D（或 2D 投影）（默认）使用预训练的卷积神经网络 StarDist 来识别荧光显微镜图像中的细胞核。一般来说，这种方法对于多种样品都非常有效。
• 细胞姿态分割 2D（或 2D 投影） 使用深度学习网络 Cellpose 来识别整个细胞或细胞核。如果您想要测量整个细胞中的焦点，或者您更喜欢 Cellpose 细胞核分割而不是 StarDist，请使用此选项。 Cellpose 需要额外安装（参见Installation / Requirements）。

  • Cellpose 分割 3D：如果选择此选项，则会弹出一个包含额外设置的新对话框。这些是 3D 分割最重要的参数。可以在“其他 Cellpose 参数”字段中添加更多参数。 Help按钮将带您进入Cellpose CLI，其中包含所有参数的说明。

  • 经典细胞核分割允许用户使用手动/自动阈值分割细胞核，这是出于遗留原因而提供的。该方法几乎总是优于其他两种方法。
  • 从文件加载 ROI：可以加载 ImageJ ROI .zip 文件而不是执行分割。此选项用于（不久的将来）QuPath-Fiji 工作流程。 ROI 文件应与输入图像同名，不带扩展名，后跟“_ROIs.zip”。
  • 加载标签图像允许加载标签图（如果分段已由外部程序完成），或者快速重新运行具有相同分段的文件。标签图像文件应存在于另一个文件夹中，并且与输入图像具有完全相同的名称。
• Stardist 核重新缩放因子 [1-n]，0 表示自动，1 表示不重新缩放：Stardist 在中等分辨率图像上进行训练，通常在像素大小约为 0.2-0.5 µm 的图像上表现良好。对于像素尺寸小得多的图像，StarDist 倾向于“过度分割”原子核。设置为 0 可自动将细胞核重新缩放至 0.25 µm 的最佳像素大小，或设置任何其他数字以手动控制重新缩放。注意：如果像素单位不是μm，则不执行重新缩放。 该选项仅影响细胞核分割；它与前面提到的“XY binning”参数不同，后者也会更改焦点通道的像素大小。 （默认值：0）

-概率/流量阈值[0.0-1.0]（StarDist/Cellpose）：较低的值将接受更多的细胞核/细胞；值越高，要求越严格。对于 Cellpose，这实际上是 flow_threshold 参数。 （Cellpose 的 Cellprob parameter 影响较小，始终设置为 0。）（默认值：0.5）

• Cellpose 细胞直径（像素），0 表示自动：细胞的估计直径（以像素为单位）。将此参数设置为 0 将触发 Cellpose 进行估计。请检查斐济控制台以获取估算结果。

• Cellpose model ：用于分割的model（内置或自定义）。已测试至 Cellpose 3.1.1.1（Cellpose 4 现在使用不同的命令操作 - 很快就会提供支持）。

• 删除直径小于（单位）的核：小于面积与该直径对应的圆的物体将被删除。 “单位”取决于图像，并且几乎总是“μm”，或者在 pxiel 校准值丢失的情况下为“像素”。 （默认值：4）

• 去除直径大于（单位）的核：同样，但对于大物体。 （默认值：50）

• 排除图像边缘上的核：选中后，将不会分析接触图像边缘的核。 （默认值：选中）。

• 手动细胞核去除：允许用户在分析前擦除不分段的细胞核。 （默认值：不用了，谢谢）选项：

  • 不，谢谢意味着无需手动编辑细胞核
  • 手动删除细胞核：用鼠标左键单击图像中的细胞核来删除细胞核。编辑内容将保存到输出文件夹中的一个小文本文件中。
  • 加载以前保存的去除（从输出文件夹）：如果您之前在此图像上编辑过分割的细胞核，它将从指定输出文件夹中的文件加载以前的细胞核去除。 （因此，如果更改输出文件夹参数，此选项将不起作用。）

焦点检测设置

• 预览焦点检测（用于参数微调）？：选中此项将允许用户在量化之前在预览分析中调整焦点检测设置。 （默认：选中）

• 焦点大小通道 A/B（XY 合并后）：微小、小、平均、大、巨大和其他之间的选择。此参数控制多个焦点图像过滤步骤，并引导宏检测更小或更大的焦点。 （默认值：平均）。

-焦点检测方法：

• 标记控制的分水岭使用 MorphoLibJ 的 marker-controlled watershed 和局部最大值作为种子来分割焦点
• AreaMaximum 检测 倾向于仅检测焦点的峰值。当其他选项无法提供令人满意的结果时可以尝试。此选项需要安装 SCF MPI CBG Fiji 更新站点。
  • 手动阈值允许用户在（背景校正和过滤的）焦点图像上手动设置阈值。

• 焦点强度阈值偏差通道 A/B：宏将自动估计焦点检测的强度阈值（在高斯差背景扣除之后）。该默认阈值设置为图像中所有核中核背景信号中值标准差的 3 倍。用户可以使用滑块将该阈值偏置到较低值（接受更多低强度焦点）或较高值（面向高强度焦点）。偏差滑块以指数方式耦合到所使用的阈值：阈值=estimated_threshold * e^bias。 由于最小和最大滑块值为 (-2.5, 2.5)，因此阈值可以设置为核背景信号标准差的 0.2 到 36 倍之间的任意值。 （默认值：0）

• 最小焦点尺寸（像素/体素）：占据小于此值（以像素/体素为单位）的面积/体积的焦点将被删除。请注意，对于标记控制的分水岭检测方法，2D 图像的最小焦点尺寸为 5 pixels，3D 图像的最小焦点尺寸为 7 voxels。因此，设置小于此大小的尺寸不会改变检测到的焦点的数量。

• 最大焦点尺寸（像素/体素）：焦点尺寸的上限，以像素/体素为单位。

• 细胞核/细胞外焦点的最大距离（单位）； -1 表示完整图像：这控制细胞/细胞核分割焦点外的距离（以单位（=微米）为单位）仍应计数。 （默认值：0）

• 共定位焦点的最小重叠：通道 A 和 B 中的焦点将被计为共定位*仅当它们至少与此区域/体积（以像素/体素为单位）重叠时。

可视化选项

• 细胞核/细胞覆盖选择：选择将哪些数字添加到覆盖中：细胞核/细胞 ID、焦点计数、两者或无。

• 细胞核/细胞标签颜色：细胞核/细胞 ID 文本叠加的颜色。

• 焦点计数标签颜色：焦点计数文本叠加层的颜色。

• 细胞核/细胞标签字体大小：细胞核/细胞 ID 文本叠加的大小。

• 细胞核/细胞轮廓亮度：细胞核轮廓叠加的亮度：亮或暗。

• 细胞核/细胞轮廓颜色：细胞核轮廓叠加的颜色。

• 调试模式（显示中间图像）：用于开发和错误修复：选中此选项将触发在处理过程中显示许多中间结果。它还会减慢分析速度。

焦点检测优化

当选中_预览焦点检测（用于参数微调）？_选项时，将在处理过程中显示检测到的焦点的预览图像。出现一个对话框，可以在其中调整焦点检测参数（有关说明，请参阅foci detection settings）：

在Action下有四个选项：

• 使用这些设置重新计算：使用当前参数重新运行焦点检测。分段保持不变。 （默认）
• 完成优化\处理并优化下一个图像：完成当前图像的分析并再次显示下一个图像的对话框。
• 完成优化\使用这些设置处理所有其他图像（计算每个图像的阈值）：使用当前设置对所有后续图像执行分析。为每个图像估计和计算焦点阈值。绝对阈值取决于图像特征（参见foci detection settings），并且可能因图像而异（略有不同）。
• 完成优化\使用这些设置处理所有其他图像（修复当前阈值级别）：使用当前设置对所有后续图像执行分析。计算出的该图像的绝对焦点阈值用于所有其他图像。当处理较大图像的单独图块时，此设置非常有用。

更改设置后，单击OK将使用更新的参数检测相同核上的焦点，并在预览图像中重新显示它们。在优化步骤之间会记住通道显示设置和缩放。 预览图像显示了一个 ImageJ 超堆栈，除了 3D 图像的 z 切片（如果适用）之外，还包含两个代表焦点通道 A 和 B（如果适用）的帧，以及四个通道：

1. 细胞核染色通道（天蓝色） 2.原始焦点数据（绿色）
2. 检测到的焦点（洋红色）
3. 检测到的焦点的质心（白色）

下图显示了此类超堆栈的蒙太奇布局，其中垂直方向为“帧”（焦点通道 A 和 B - 这里为 2 和 3），水平方向为“通道”（如上所述）：

通过更改显示的通道 (Shift-Z)、调整通道的亮度和对比度 (Shift-C) 以及放大（“+”和“-”键），用户可以检查两个焦点通道的焦点检测，根据需要调整检测参数并重新运行焦点检测步骤。特别是，取消选中通道 1（细胞核），然后交替显示通道 3（检测到的焦点）是最有帮助的。

延时图像

当检测到延时图像时，各个帧将被分割并保存到磁盘。然后该脚本一一分析这些单帧图像并保存结果。 目前，延时图像尚未重建。这可以通过运行 Foci-Analyzer Fiji 子菜单中的 Concatenate timelapse with overlays 来完成（Plugins -> Foci-Analyzer）。

对所有帧执行concatenating the result files之后，可以从Foci-Analyzer子菜单运行Plot foci timetraces。这将从 Results 表中读取数据，并生成一个表，其中包含每个时间范围内每个单元格的焦点计数以及一个绘图。注意：此功能是实验性的，正在开发中。

＃＃ 输出

文件

对每个图像/帧进行分析后，将显示以下输出表。这些保存在指定的输出文件夹中：

1. 以 overlay_ch...zip 结尾的 .zip 文件，包含上述通道，带有分段细胞/细胞核轮廓，以及细胞核 ID 和/或焦点计数作为文本覆盖。该图像还包含（几乎）所有分析设置作为元数据（Image -> 在斐济显示信息…），这对于文档/再现性目的以及在另一图像上重新使用相同的设置很有用（通过loading them）。

2. 当选中Also detect foci in Channel B and perform colocalization时：以foci_coloc_map.zip结尾的.zip文件，包含colocalization maps。在这里，分析设置也存储在元数据中（斐济的Image ->“显示信息…”）。

3. 以 Foci_results.tsv 结尾的文件，其中包含_每个细胞/细胞核_的统计数据，具有以下列：细胞面积/体积、背景强度（细胞核外）、平均强度、总强度、阈值（过滤后的图像）、焦点计数、平均焦点强度、中位焦点强度、平均焦点体积、中位焦点体积、总焦点体积、焦点通道的总焦点强度，如以及核通道的_背景强度、平均强度、总强度_。当执行共定位时，该表还包含：重叠焦点计数、重叠焦点体积、重叠计数% ch_A、重叠体积ch_A、计数% ch_B、重叠计数% ch_B、重叠体积ch_B。

4. 以 All_Foci_statistics.tsv 结尾的 .tsv 文件，包含每个单独焦点的关系信息和强度信息：label、Cell ID、Mean、StdDev、Max、Min、Median、Skewness、Area/Volume、Circularity/Sphericity、Centroid.X、Centroid.Y、(Centroid.Z)。 （质心相对于图像原点的坐标。）

日志

分析完成后，完整的日志窗口将在输出文件夹中保存为 Log.txt。

共定位图

该宏为两个选定通道中的焦点生成重叠图，以可视化不同通道中焦点的重叠。该地图有 6 个通道：

1.检测到的焦点掩模通道A（绿色） 2.检测到的焦点掩模通道B（红色）

1. 与通道 A 重叠 % foci count（天蓝色；越亮，焦点重叠越多）
2. 与通道 A (Manders M1) 重叠的 % 焦点_面积/体积_（洋红色）
3. 与通道 B (天蓝色) 重叠 % foci count
4. 与通道 B (Manders M2) 重叠的 % 焦点_面积/体积_（洋红色）

处理结果

对于每个图像（或帧）都会生成一个新的结果文件。当处理多个图像（或帧）时。可以通过在 Foci-Analyzer Fiji 子菜单中运行 Combine result files 来附加文件夹中的结果 .tsv 文件。生成的表作为 Results_all_files.tsv 保存在与输入 .tsv 文件相同的文件夹中。 （顺便说一句，该脚本也可以在其他基于文本的文件上运行，例如 .csv、.txt。）

使用 QuPath 和 Fiji 对大图像进行焦点量化

Foci Analyzer 可以与 QuPath 结合使用，从而能够对非常大的图像进行焦点分析。为此，我们开发了一些groovy脚本(on Github)。来自注释区域的图像图块以及细胞分割从 QuPath 导出并在斐济进行分析。焦点结果可以导入 QuPath，从而可以根据细胞的焦点特征对细胞进行分类。