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闪光

FLASH（朗读自动空间组织学）是一个 ImageJ/Fiji 插件，用于对多通道朗读工作站项目进行可重复的批量分析。该项目和 ROI 设置、图像准备、经典和人工智能驱动的分割、朗读强度测量、3D 对象重构、共定位、空间和形态分析、统计、演示图像导出以及运行记录整合到一个工作流程中。

FLASH 专为包含图像、动物、区域、半球或实验条件的项目而设计，这些项目需要相同的分析决策和一致的组织输出。

安装

FLASH通过ImageJ更新站点分发：

https://sites.imagej.net/FLASH/

需要安装它：

1.启动斐济。 2.选择Plugins › FLASH。 3.点击“管理更新站点”。

  1. 启用FLASH（如果已上市），或单击添加未上市的站点并输入：
    • 姓名：FLASH
    • 网址：https://sites.imagej.net/FLASH/ 5.应用更改并重新启动Fiji。

使用Help › Update…打开管道。安装还添加了Help › About FLASH用于运行历史记录和Plugins › FLASH Runs…。

项目和主窗口

FLASH 在 FLASH Home 开始。其最近的项目面板显示以前打开的项目，而开始某事接受放置的项目文件夹或提供浏览文件夹和+新项目。

FLASH项目构建器可以从多个文件夹或单个文件组成一个项目。它提供：

  • 项目名称和输出根，可以与源图像文件夹不同
  • 添加文件夹…、添加文件…、打开项目…和打开最近的…
  • 每个文件和每个系列的包含、动物、半球、区域、条件和注释字段
  • 其他条件轴，例如基因型、时间点、性别或治疗
  • 名册导入/导出、命名语法编辑、身份推断和低可信度元数据审查
  • 保存并打开编写项目清单并进入管道

主窗口的标题为FLASH - 荧光自动空间组织学管道。它的快速启动面板显示选择一个配方或单独进行勾选分析。内置按钮包括：

  • 标准 3D + 强度
  • 快速细胞计数
  • 完整管道
  • 演示
  • 快速交付结果
  • 最后一次运行
  • 清晰的食谱
  • 将选择保存为食谱…

顶部面板还显示 当前项目 和 更改项目… 和 编辑设置…，以及 条件 和 查看条件…。

可见分析行分组如下：

  • 设置：设置配置；稀疏ROI并定向图像
  • 图像准备：3D解析；光谱净化（实验）
  • 显示：制作演示图片；制作代表性图片
  • 图像分析：语法强度分析；3D对象分析；空间分析
  • 结果与验证：根据条件/动物组合结果； 统计分析； Excel摘要导出

每行都有一个状态提示和一个帮助按钮。页脚包含检查我的数据、选项和依赖项；主运行按钮启动选定的模块。

引导设置和预览

设置配置定义下游分析重复使用的通道配置。它的通道标识和颜色、过滤器、显示范围、强度和对象阈值、对象大小限制、分割引擎和可选的Z切片选择。

主要配置存储在：

FLASH/Config/.settings/channel_config.json

同一文件夹中的Channel_Data.txt是派生的兼容文件。不完整的设置可以恢复，并且取消提供保存并退出、继续工作或放弃并退出，因此部分工作不会默默丢失。

可以通过总体最小和最大或每个条件的最小和最大手动、随机选择设置图像。每个条件选项对图像强度进行采样，并在每个条件下选择弱和亮的提示，帮助用户在批处理检查条件每个数据顶部的阈值之前和显示范围。

设置质量控制使用嵌入式FLASH预览，源图像定位调整或输出图像上方。 大视图在有用时打开更大的比较。更新显示范围和阈值变化实时；滤色、StarDist、Cellpose、反方向和3D对象预览可通过显式预览按钮重新运行。

根据选定的设置，设置审查包括过滤器参数、显示最小/最大、强度和对象阈值、粒度过滤、反重力和选定的分割引擎。 参数变化…可以在接受参数集之前渲染支持的模块、反梯度、经典、StarDist 和 Cellpose 设置的比较网格。

过滤器和宏构建

FLASH包含针对常见指纹图像问题的预设框架：

  • 默认
  • 点状信号/高背景
  • 分支细胞（小星形细胞/星形星形细胞）
  • 簇状小
  • 自然资源大
  • 细胞标记重叠
  • 点解决
  • 漫反射对象
  • 定制

当选择自定义时，用户可以选择：

  • 逐步构建
  • 记录我在斐济所做的事
  • 导入现有的宏文件

可视化过滤器构建器公开可用步骤、您的过滤器、步骤设置和合并分支，并支持控件分支。 从预设开始…、预览到选定的步骤和预览完整过滤器帮助用户在实际项目视图上构建和检查链。

自定义过滤器保存为ImageJ宏(.ijm)，对于可视化图形，保存为.dag.json sidecar，以便可以重新打开和编辑图形。自定义过滤器默认可以在以后的设置运行中重复使用。

分割引擎

一个项目中的不同通道可以使用不同的结构引擎。例如，核通道使用StarDist，而全细胞或分支标记使用Cellpose，两个标签输出都提供相同的对象、共定位、空间、聚合和导出步骤。

用户界面支持：

  • 经典：过滤器、阈值和基于大小的分割
  • 增强经典：带有附加3D对象过滤的经典分割
  • StarDist 3D：StarDist 检测每个切片的 2D 并通过 Z 连接来生成 3D 标签
  • Cellpose：携带模型、直径、概率、流量、周围通道、GPU和尺寸控制的 Python Cellpose 分割

正常设置 UI 可以通过 自定义模型管理器 注册特定项目的模型。 StarDist 导入必须是与 Fiji 兼容的 TensorFlow SavedModel .zip 导出。 Cellpose 使用支持的模型文件或可以注册的模型名称。

FLASH v5 引脚 Cellpose 3.1.1.2；不支持 Cellpose 4、Cellpose-SAM 和 cpsam 型号。在重新设计工作流程时，点击训练路线是隐藏的，因此正常的设置 UI 收集不会点击预览或提供点击导出的参数建议。

项目模型文件和元数据存储在：

FLASH/Config/Segmentation models/

批量处理

FLASH 将保存的项目配置评估多个图像，而不需要一次设置一个图像。 管道选项公开：

  • 处理
  • 线程数
  • GPU推理允许（0 =自动检测）
  • 将图像存储为TIF
  • 文件覆盖行为：自动覆盖或跳过现有
  • 自动保存汇总摘要
  • 生成质量控制报告

大量执行使用内存资源的工作人员大小调整、有界图像加载队列和队列检查。StarDist 和 Cellpose 共享 GPU 推理允许限制，因此同时进行的深度学习作业不会超过配置的并发数。自动检测会考虑 GPU 内存、Java 堆和系统 RAM。

TIF存储存储在FLASH/Cache/TIF/下，允许对大型生物格式容器进行重复分析，以重用提取的图像数据。

ROI、方向和图像准备

相关 ROI 和定向图像 ROI 绘图以及旋转和翻转按钮打开每个图像。ROI 集、ROI 元数据和保存的方向转换可在以后的分析中使用，并且 ROI 重新运行在重复使用中。该工作流程还可以保存命名的解剖参考线，用于空间分析中的可选距离测量。

3D反方向可以在分割或强度测量锐化Z堆栈之前。其设置中心引擎选择、PSF源、呼吸元数据、通道波长、Z离散、迭代、正则化、前置和存储。可用的引擎依赖于斐济的安装可以，包括CLIJ2 FFT、DevolveLab2和Iterative Deconvolve 3D，并安装了EPFL PSF生成功能。

光谱净化（实验）支持渗透和自定义荧光校正工作流程。它可以读取校正图像、浓度、浓度、参数图、对象分数、浓度和汇总表以及QC预览。

演示图片和代表性人物

制作演示图像是显示导出工作流程。它可以应用保存的LUT和显示范围、创建分割通道和合并合成、注释图像、平铺输出以及写入OME-TIFF文件。这些输出用于目视审查和图形准备；解决不了变化替代名义测量。

制作可视化图形通过可视阶段统计、条件、选择图像、显示范围、布局和构建条件创建创建可视化图形。图形选择可以使用：

  • 快速：每个通道最亮 1% 随
  • 现有结果：现有结果 CSV 中的数字列
  • 无：手动选择，无指导统计数据

用户可以为每个条件选择一个图像系列、查看显示范围、排列条件和通道图块、添加注释、设置输出 DPI 并预览最终布局。该工作流程将在第 FLASH/Results/Presentation Images/Representative Figures/ 下写入全格式 PNG 以及选定的单独/通道 PNG 和原始 TIFF。

强度和 3D 对象分析

荧光分析测量保存的ROI或通道诱导通道内的荧光。支持ROI平均信号、阈值正信号、积分积分、积分密度、原始积分密度和受另一个通道限制的强度。每个通道的表写在：

FLASH/Results/Tables/Intensity/

3D对象分析使用为每个通道配置的引擎对对象进行结构、统计和测量。输出可以包括对象表、结构的质心和坐标、体积和形状测量、标签图像、手势、结构比较、坐标的强度值、处理长度结果和分析详细信息。

跨通道测量包括结构重叠、质心重合(CPC)、强度共定位以及任选的边界重叠或质心测量。

对象强度分析控件可以使用以下方法测量合作伙伴通道信号在每个对象内部或周围的分布情况：

  • 径向假定（距中心的距离）
  • 边缘 X / Y / Z 对称（图像轴）
  • 旋转对象（对象自己的轴）
  • 角度单一（环多边）
  • 同心壳coloc（内/中/外）
  • 框内相关性（皮尔逊/重叠）

配置文件表写入FLASH/Results/Tables/Object Intensity Profiling/；启用后，汇总配置文件数据将写入FLASH/Results/Analysis Images/Object Intensity Profiling/。

空间、形态和纹理分析

空间分析使用现有对象 CSV 和标签图像，而不是重新运行分割。它可以添加：

  • 通道对之间的最近邻距离和最近对象身份
  • Ripley 的 K/L/G 统计数据
  • CPC摘要和多目标空间摘要
  • Voronoi 区域和交互矩阵
  • 空间热图
  • 群体表型分析
  • 2D和3D形态测量、重点和空间形态测量指数
  • 物体到命名解剖参考线的距离

对象和纹理复杂性部分添加来自原始信号和现有标签映射的每个对象的测量：

  • 物体纹理（GLCM；慢）
  • 物体复杂性（分形 + 空隙性；缓慢）
  • 物体纹理类（慢）
  • 原生3D纹理（GLCM + 纹理类；非常慢）

使用 Morph_ 和 MorphTexture_ 列将结果添加到每个通道的对象 CSV 中。空间表、形态测量详细信息、热图和更新的对象表在 FLASH/Results/Tables/ 和 FLASH/Results/Analysis Images/ 下组织。

聚合、统计和Excel导出

合并每个条件/动物的结果将每个图像和每个ROI表格合并到项目摘要中。它支持按动物、条件、半球、区域、部分、ROI或图像进行分组，并在需要存在ROI体积数据的情况下提供原始和按体积输出。

项目级文件按照FLASH/Results/Tables/Project Summary/编写，包括：

3D Objects.csv
Image Intensities.csv
Image Intensities_MIP.csv
Image Intensities_3D.csv
Conditions.csv
Statistics.csv

统计分析从项目汇总表中运行配置的独立或配置组比较。它支持自动分配路由、强制参数或非参数分析、多组事后测试、调整p值以及在没有足够可用数据的情况下记录指标的跳过原因。

Excel摘要导出将现有项目摘要、条件、可选统计数据和分析详细信息备份为：

FLASH/Results/Summary.xlsx

根据所选的导出预设，工作簿可以包含实验条件、数据摘要、原始和摘要指标表、统计数据和方法附录。导出不会重新运行分段、测量、聚合或统计测试。

运行记录、质量控制和输出

FLASH 在 FLASH/Results/START_HERE.html 处开始起始页，并启用后，在 FLASH/Results/QC/QC_Report.html 处编写 HTML 质量控制报告。QC 内容可以包括全局设置、每次分析参数、分段统计、反维度检查和光谱预览。

另外分析运行都会在FLASH/Results/Run Records/下记录其设置、输入、输出、状态、评分和预览版本。Plugins › FLASH Runs…打开FLASH运行，其中按分析、状态或日期过滤运行。可用的操作可以包括打开输出文件夹、查看设置…、逐字复制和与父级进行比较。再现的运行指向重播工作区，是覆盖原始输出树。

主要输出布局是：

Project/
|-- input images
`-- FLASH/
    |-- Config/
    |   |-- .settings/
    |   |   |-- project.json
    |   |   |-- channel_config.json
    |   |   `-- Channel_Data.txt
    |   `-- Segmentation models/
    |-- Results/
    |   |-- START_HERE.html
    |   |-- Summary.xlsx
    |   |-- Tables/
    |   |-- Presentation Images/
    |   |-- Analysis Images/
    |   |-- QC/
    |   `-- Run Records/
    |-- .settings/
    |   |-- Presets/
    |   `-- status.json
    `-- Cache/
        `-- TIF/

典型输出包括配置JSON、过滤器宏和图形sidecar、ROI集、方向元数据、CSV、表格标签图像和蒙版、演示PNG和OME-TIFF、代表图、去倾向或去污图像、热图、剖面图、质量控制报告、运行记录、重播工作区和Excel摘要工作簿。

支持的输入

FLASH专为多通道荧光支架项目而设计。它利用Fiji和Bio-Formats进行常见的通道支架和TIFF工作流程，包括：

  • 徕卡LIF
  • 蔡司CZI
  • 尼康 ND2
  • OME-TIFF 和 TIFF 堆栈

项目元数据可以来自文件名、源文件夹、图像元数据、项目表编辑、命名语法或导入的名册。

运行时依赖

即使缺少可选依赖项，FLASH 染色体也会打开。需要它们的功能时会显示修复消息和修复指南。

主窗口依赖项按钮打开管道依赖项，它检查每个运行时并识别隧道的功能。根据选定的工作流程，可选运行时可以包括Bio-Formats、3D对象粒子、3D对象粒子+、mcib3d、StarDist/TrackMate、TensorFlow本机库、Cellpose、Apache POI、JTS、Coloc 2、反原型引擎、PSF生成器和支持图像处理库。

宏和无头使用

项目配置存在后，可以从ImageJ宏和无头工作流程驱动FLASH。例如：

run("FLASH", "dir=[/path/to/project] run_3d run_intensity run_aggregate run_excel");

CLI选项可以选择分析和控制负荷处理、线程统计、缓存、覆盖行为、默认、聚合、统计、Excel导出和保存的代表图重新渲染。控件设置本身需要GUI，除非提供设置默认或显式通道选项。