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快速河马

#单细胞痕迹的FLIM分析，用于混合光学筛选中表型的精准鉴定

FAST-HIPPOS 是斐济用户脚本的集合，用于分析和可视化细胞多延迟实验、根据设置的标准检测命中细胞并输出其阶段坐标，例如光活化。 对于非筛选应用，它可以作为单细胞痕迹分析、可视化和检查的有价值的工具。

安装和要求

需要激活Fiji Update Sites（通过帮助 -> 更新… -> 管理更新站点）：

  • 快速河马
  • CLIJ
  • CLIJ2
  • (CSB深)
  • 图像科学
  • IJ-PB 插件
  • PTBIOP
  • SCF MPI CBG -（星距） 另外，您还需要一个可运行的 Python 中的 Cellpose（2.0 或更高版本）环境。有关安装说明，请参阅第 Cellpose GitHub Readme。（注：FAST-HIPPOS 已在 Cellpose 3 上进行了测试。虽然它也可以与 Cellpose 4 (Cellpose-SAM) 配合使用，但最新的 Cellpose 3 版本可以使用 pip install cellpose[gui]==3.1.1.2 安装。）

在运行 FAST-HIPPOS 时，请确保 BIOP Cellpose wrapper 正常工作：遵循其installation instructions。然后，通过填写 Plugins -> BIOP -> Cellpose/Omnipose -> Cellpose... 中的顶部两个字段，确保包装器之前知道您的 Cellpose 环境位于何处以及其类型（conda 或 venv）： BIOP Cellpose wrapper 您可以在 Fiji 菜单的 Plugins -> Macros 下找到 FAST-HIPPOS 命令。下面是主命令的说明：FAST-HIPPOS。其他命令的详细信息如下。

FAST-HIPPOS 工作流程

  1. Input images
  2. Pre-processing
  3. Cell segmentation
  4. Measuring single-cell (FLIM/intensity) traces
  5. Visualization
  6. Hit selection
  7. Output files

    1.输入图像

    输入图像是多通道.tif文件，或supported by Bio-Formats的任何胚胎发育格式，包括包含多个图像的文件。 FLIM以多种方式支持（主要针对徕卡图像）：

    • 共焦 TCSPC：生命周期组件图像，配备指数并从 LASX 导出双（作为“原始 ImageJ tif”）。
    • TauSeparation，直接来自.lif文件
    • 快速FLIM
    • TauContrast
    • Lambert Instruments 频域 FLIM（.fli文件）（注意：此选项需要当前暂停的其他参数。）

支持的非FLIM Image有：

  • 成像效果（2通道.tif文件）
  • 强度（单通道.tif文件）

该宏还可以批量处理多个文件。只需将多个文件拖放到输入窗口中，或使用Add files按钮即可。

2.离婚（任选）

或者，图像校正可以作为创建步骤执行： 1.多平铺实验的拼接。这是通过单独的Stitch tiles（针对Leica .lif命令文件进行测试）完成的。仅从输入文件夹加载（单图块）.tif并文件考虑进行拼接。使用Grid/Collection Stitching plugin执行快速“无”拼接，以确保正确的像素大小[^1]并防止图像失真。图块的XY舞台坐标从.lif文件的OME元数据中提取，并与网格布局、图块大小和图块重叠分区一起存储在安东尼的第§§4§§§文件中。（目前重叠分区是手动设置的。）

  1. 补充校正。图像帧的互相关（cc）是与第一帧、前一帧或最后一帧执行的。CLIJ2图像投影函数用于快速确定互相关图像中最大像素的坐标，其距中心的距离代表偏移。对计算的强度图像添加补充校正（即，两个小，如果适用）。
  2. 另一个扫描仪相位失配校正。偶数线和奇数线被分割并变成两个单独的图像。交叉连接这些图像并定位对准会产生相位之间的偏移。两个图像都移动了一半的距离并交错： [^1]：导出的像素大小不正确，导致单元格坐标随着x和y的增加而完全增加偏差。

image

在这些任选步骤之后，将创建“加权生命周期”图像。对于单数量 FLIM 图像（“FAST FLIM”、“TauContrast”、频域 FLIM），这只是消耗；对于二数量 FLIM 图像，这相当于强度加权消耗。（请注意，这里的强度是消耗少量的强度！） 另外，还要创建“RGB增加图像”，其中该消耗图像的(x,y,t)平滑版本乘以（增加）总强度图像，从而产生实验的去噪可视化。此图像创建是可选的，但强烈推荐。§§§0§§命令也需要它（在最后描述中）

Cos7H250_ADRB2KO_1 (weighted lifetime) Cos7H250_ADRB2KO_1 (lifetime intensity RGB overlay)

3. 细胞分割

细胞分割可通过CellPose（2 或 3）进行，在斐济使用a wrapper进行操作。首先使用子集或所有延迟图像的总强度投影来“折叠”图像堆栈，从而产生单个图像稀疏。如果推理时间足够短从而细胞不会（大量）移动，则此过程效果很好。 用户可以选择分割模型（预训练或自定义），并需要提供一些关键参数，例如细胞直径和flow threshold。此外，还可以对单元尺寸和圆形尺寸施加限制。 Cos7H250_ADRB2KO_1 (lifetime intensity RGB overlay)

4. 测量单个细胞（FLIM/强度）痕迹

细胞分割后，根据获得的标签图像创建ROI，然后计算每个细胞在时间点的强度和平均加权消耗。该平均消耗是加权消耗，其中每个像素与强度分数进行线性加权。

该脚本通过检测所有细胞平均迹线的二阶导数中的最高，自动尝试确定激动剂刺激和调整的时间点。如果达到信号标准差的设定次数，底部成功拾取该信号。如果，细胞迹线将分成三个部分：基线、响如果没有，也可以手动输入时间点。这三个分区视为用于筛选动态表时检测命中细胞。如果没有找到或设置刺激和调整框架，则完整的统计被视为响应*。如果仅发现最高峰，则将其刺激。 （注意：目前仅检测到人口/比例上升！） first and second derivative of the average trace

5. 可视化

数据以各种图表和图像的形式可视化：

时间痕迹图

A23f8818 b754 4b01 93ab b5e1a6dff63e

Timelapse 寿命直方图和散点图

电影

  • 细胞寿命/比率的直方图
  • 寿命与细胞强度和寿命与细胞面积的散点图 Kymograph

Sorted Kymograph

Kymographs

这是一张图像，其中时间为 y 坐标，细胞 ID 为 x 坐标，细胞寿命为值。此外，还会创建一个“排序的 kymograph”，其中 X 轴根据平均响应寿命进行排序。 Cos7H250_ADRB2KO_1 (kymograph) Cos7H250_ADRB2KO_1 (kymograph sorted)

###密度图 直视二维方图，y轴为消耗量，x轴为时间。与时间血糖图相比，该图像可以更好地以视觉方式评估血糖的异质性。 Density plot

6. 筛选：命中选择

当在启动对话框中选择activate screening时，可以检测到表现出某些动力学行为的细胞，并将这些“命中”细胞的阶段坐标写入.rgn文件中，用于后续光激活（或例如高分辨率成像、运行 FRAP 实验等）。然后可以将该文件加载到 Leica LAS X Navigator 中，其中命中的单元格将被标记为成像位置。 由于存在许多可能有趣的动态表型，因此该脚本提供了几种可能的规则和标准，可以在需要时进行组合（AND / OR）。 它还提供了可能性

  • 在已分析的图像上重新应用筛选设置，为此脚本从主对话框中指定的输出文件夹加载图像和文件。
  • 从分段单元格生成随机命中（用于测试目的）。

    日程调节面板

    Hit detection settings dialog Specific details:

  • Stimulation and calibration frames can be entered manually, or choose 0 for ‘baseline only’ mode.
  • The option to curve fit a user-defined equation to the reponse part of the traces is currently disabled.

    时间轨迹点击图

    命中检测后，会生成一个图表，仅显示命中单元的痕迹。此处，命中选择中使用的选定时间窗口（在本例中为完整响应时间）以蓝色突出显示。与包含所有单细胞迹线的图进行比较： lifetime traces plot - hits only lifetime traces plot 命中的单元格也以图形方式显示在表格中，以及它们的位置： hit cell positions map hit cell table

    7. 输出文件

    每个图像都会生成许多输出文件：

  • Labelmap_cells：包含分割单元格作为标签的标签图像
  • 强度和标签图：可用于检查分段的覆盖图
  • 加权寿命：包含如上所述的加权寿命的32位图像。
  • Kymograph 图像（原始、平滑并根据响应排序）
  • 排名向量：（辅助图像允许根据响应对单元格进行排序）
  • 生命周期轨迹图：所有单细胞轨迹
  • ROIs.zip：包含 imageJ ROI 的 zip 文件
  • ImageJ 日志窗口的 Log.txt 副本
  • Cell_statistics.tsv：包含所有细胞的原始形态和强度数据的文件
  • Stim_&_Cal_frames.txt：文件说明刺激和检测发生的帧（设置或检测）
  • 寿命和强度 RGB 叠加（可选）
  • 终身直方图电影（可选）
  • 散点图（可选）
  • Intensity.tsv：每帧的单元格强度表（可选）
  • Lifetimes.tsv：包含每个帧的单元寿命的表（由于当前转置的技术原因）（可选） 执行筛选时会创建一些附加文件：
  • 命中列表.tsv：包含命中单元格的表，按所选标准的测量值和xy阶段坐标排序。如果命中的单元格数量超过设定的限制，则进行分块。
  • .rgn 文件，其中包含 LAS X 的预定位置
  • 唯一目标痕迹图
  • kymographs（命中和非命中）
  • 生命周期直方图（命中和非命中）
  • 密度图（命中和非命中）
  • 命中细胞 xy 位置的图形表示

跟踪检查和手动选择日程

分析后，可以使用Inspect and select traces命令交互式地检查单元和迹线。运行它后，会出现一个带标记选项的对话框，允许在“检查”和“选择”模式之间进行选择。单击确定后，窗口重新排列。

巡检模式

当鼠标光标移动到单元格和迹线上方并激活窗口时，它们会在排序的记号图、迹线图和RGB中央图像中突出显示。

左键单击排序的图形或RGB增强图像中的单元格会显示绘图中选定的迹线，其他迹线呈灰色显示。

左键单击绘制的迹线可生成相关单元格的最终的 RGB 右上角图像。

Ctrl + 左键单击并拖动已排序的kymograph创建图像临时选择。选定的单元格在RGB上升层中突出显示。该图仅显示选定的单元格。

选择模式

在这种模式下，可以在排序的Kymograph、绘图或RGB灰度图像上获得较差的ROI。在以后的一种情况下，这也可以是多点的ROI。 选定的单元重复格在突出显示。此外，仅使用选定细胞的位置创建.rgn文件，允许“手动”型表筛选。